论文部分内容阅读
背景脓毒血症急性肾损伤（Sepsis-Associated Acute Kidney Injury,SA-AKI）是重症监护室最常见的AKI类型,在临床上具有较高的发病率和死亡率,其发病机制不同于缺血再灌注导致的AKI,至今尚未完全阐明。既往研究发现,肾小管上皮细胞线粒体损伤是导致SA-AKI的重要机制,干预线粒体损伤,保护线粒体可能成为治疗SA-AKI的有效手段。Humanin是2001年在阿尔茨海默症患者脑组织中发现的一种内源性线粒体保护蛋白,是含有24个氨基酸的线粒体多肽。在小鼠及人的正常肾脏中Humanin表达丰富。研究显示,Humanin在心、脑等缺血再灌注损伤疾病中具有强大的线粒体保护作用,其机制可能与抗凋亡、抗炎症、调节自噬及维持线粒体稳态等相关。Humanin在AKI中是否发挥保护作用,目前尚无报道。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（Peroxisome Proliferator-activated ReceptorγCoactivator-1-α,PGC1-α）是调控线粒体稳态的关键因子,可通过调控线粒体转录因子A（Mitochondrial Transcription Factor A,TFAM）的转录和表达,促进线粒体的生物发生,发挥保护作用。有研究证实Humanin能上调小鼠胰岛β细胞AMPK/PGC1-α信号通路,改善线粒体损伤,在糖尿病及胰岛素抵抗中发挥保护作用。本研究旨在SA-AKI的动物及细胞模型中,探讨Humanin是否通过改善线粒体功能对肾小管上皮细胞起保护作用,为SA-AKI的防治提供新的理论基础。目的（1）明确Humanin在LPS诱导的AKI时对肾小管上皮细胞的保护作用;（2）探讨Humanin发挥保护作用的可能机制。方法（1）动物实验:6～8周龄C57BL/6小鼠腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）10mg/kg诱导SA-AKI模型,在LPS注射15分钟后腹腔注射Humanin（1mg/kg）。检测血清肌酐、尿素氮、肾损伤分子1,RT-PCR检测小鼠肾组织中炎症因子-1β（Inflammatory Factor-1β,IL-1β）和炎症因子-6（Inflammatory Factor-6,IL-6）及氧化应激相关蛋白高迁移率族蛋白B1（High Mobility Group Box 1 Protein,HMGB1）的转录水平。利用Western Blot、RT-PCR和免疫荧光染色等技术检测小鼠肾脏PGC1-α和TFAM转录及蛋白表达变化,检测促进线粒体融合的相关分子线粒体外膜蛋白Mitofusin 1（MFN1）和Mitofusin 2（MFN2）表达的变化。电镜观察肾小管上皮细胞线粒体损伤情况及自噬情况,检测自噬相关蛋白LC3-II及p62的表达变化。（2）体外实验:体外培养人近端肾小管上皮细胞株（Human Kidney-2,HK-2）,LPS（160μg/ml）诱导内毒素血症肾小管上皮细胞损伤模型,LPS刺激15分钟后加入Humanin溶液5μmol/L共培养,48小时后MTT法检测细胞活力;JC-1检测线粒体膜电位,Mitotracker标记线粒体形态;Mito SOXTM检测线粒体超氧化物含量;检测PGC1-α、TFAM、MFN1、MFN2、LC3-II及p62蛋白表达变化。结果（1）动物实验:与对照组相比,LPS处理组,血清肌酐、尿素氮和肾损伤分子1均明显升高,腹腔注射Humanin血清中肌酐、尿素氮和肾损伤分子1均明显下降。小鼠肾组织PAS染色结果显示,与对照组相比,LPS腹腔注射24小时后,个别近端肾小管上皮细胞刷状缘丢失、肾小管肿胀及轻度的空泡样变性,未见基底膜裸露、肾小管上皮细胞坏死;LPS+HN组未见明显肾小管上皮细胞损伤。线粒体生物发生相关蛋白PGC1-α和TFAM及线粒体融合蛋白MFN1和MFN2表达下调,腹腔注射Humanin上调其表达。电镜下观察到,与对照组及LPS+HN组相比,LPS组小鼠肾小管上皮细胞内线粒体损伤明显,排列紊乱,变成短棒状,明显肿胀变圆,个别可观察到线粒体嵴断裂。肾小管上皮细胞内自噬泡明显增多,自噬相关蛋白LC3-II及自噬底物p62均明显增多,腹腔注射Humanin能够明显减少肾小管上皮细胞内自噬泡的堆积,LC3-II及p62蛋白的表达明显下调。（2）体外实验:与对照组相比,LPS可引起HK-2细胞活力下降、膜电位下降、线粒体形态成片段化、线粒体超氧化物聚积,促进线粒体生物发生相关蛋白PGC1-α和TFAM及线粒体融合蛋白MFN1和MFN2表达下调,自噬相关蛋白LC3-II及自噬底物p62均明显增多;Humanin与LPS刺激的HK-2细胞共培养,可以改善上述线粒体HK-2细胞活性,减轻线粒体片段化及氧化呼吸功能损伤,上调PGC1-α、TFAM、MFN1和MFN2的表达,下调LC3-II和p62的表达。结论Humanin在SA-AKI时具有肾脏保护作用,其机制可能与减轻肾小管上皮细胞线粒体损伤及改善肾小管上皮细胞的自噬流障碍有关。PGC1-α/TFAM可能是Humanin发挥线粒体保护作用的重要信号通路。