鼠伤寒沙门菌是一种泛嗜性肠道致病菌,在水禽养殖中较常见,可引起胃肠炎、发热、腹泻,甚至死亡,严重影响水禽养殖业发展。为探讨控制广东鹅鼠伤寒沙门菌病传播的方法,减少鼠伤寒沙门菌对广东地区养鹅业的危害,本实验依据156株分离自广东地区鹅群鼠伤寒沙门菌的PFGE分子分型结果,挑选出流行株A29,通过λ-Red同源重组技术对A29菌株基因组crp和/或hfq基因进行缺失并评价缺失株的生物学特性、耐药性、对小鼠致病性及其作为弱毒疫苗的免疫保护效果,以提供针对鹅沙门菌病的减毒候选疫苗株,主要研究内容如下:采用λ-Red同源重组技术,敲除编码c AMP受体蛋白crp基因和RNA分子伴侣hfq基因,成功构建crp基因缺失株A29Δcrp、hfq基因缺失株A29Δhfq以及crp/hfq双基因缺失株A29ΔcrpΔhfq。以质粒p BR322为载体构建相关基因回复质粒,成功获得3株缺失株的回复株。测定比较A29、基因缺失株及其回复株的生物学特性。结果表明,缺失crp基因可使细菌菌体长度显著变短（P<0.001）,菌落直径显著变小（P<0.001）;使A29不能分解鼠李糖、木糖、麦芽糖,尿素酶和硫化氢试验呈阴性,但能够分解水杨苷;并不影响A29的生长速度,但使其培养液的OD600在对数生长前期低于A29、在对数生长后期高于A29。缺失hfq基因则表现为菌体长度显著变长（P<0.001）,细菌游动性下降并检测不到鞭毛抗原;不能分解木糖,尿素酶试验呈阴性;在平台期时菌落总数和OD600均下降。所有回复株与A29无差异,表明缺失株的功能异常是基因缺失所致。遗传稳定性测定结果显示,经传代60代,基因缺失株的缺失部位均能够被稳定遗传,满足作为疫苗候选株的条件之一。A29和基因缺失株药敏试验结果表明,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性下降（P<0.001）,对四环素类药物的敏感性上升（P<0.05）;A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉外的12种药物敏感性上升（P<0.001）;A29ΔcrpΔhfq对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星药物的敏感性下降（P<0.001）,对四环素类、甲氧苄啶、氯霉素、阿奇霉素药物的敏感性上升（P<0.001）,以上结果均为疫苗候选株安全性评价提供参考。小鼠感染试验结果显示,与A29相比,A29Δcrp毒力下降21.7倍;A29Δhfq的毒力下降202.2倍;A29ΔcrpΔhfq的毒力下降1256.1倍。病理组织观察结果显示A29Δhfq和A29ΔcrpΔhfq对小鼠肝脏损伤程度较轻。此外,以基因缺失株10-1LD50免疫剂量接种小鼠可有效抵抗野生型菌株A29 4×103 LD50的攻击,ELISA检测可见免疫后小鼠血清IL-2和IFN-γ含量上升,进一步为其作为疫苗候选株提供参考。本研究成功构建A29Δcrp、A29Δhfq和A29ΔcrpΔhfq,测定其生物学特性、耐药性、对小鼠的致病性并初步评价其作为弱毒疫苗的免疫保护效果,为防控鹅沙门菌病提供候选疫苗株,同时也为研究鼠伤寒沙门菌crp和hfq基因之间的功能联系奠定基础。