【背景】我国是肝癌发病的重灾区,其患病率和死亡率占亚洲近70%,居亚洲之首。原发性肝癌也是我国发病率位居第四位,死亡率位居第三位的恶性肿瘤,其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是其最常见的类型,约占90%以上。由于起病隐匿,确诊时多已到中晚期,治疗效果差,预后恶劣,是对我国人民生命健康构成严重威胁的疾病之一。我国肝癌的病因与乙型、丙型肝炎病毒感染密切相关,这类慢性炎症性疾病后期所导致的肝纤维化、肝硬化是诱发肝细胞癌变的罪魁祸首。目前,全世界对肝癌的治疗并不理想,对于早期患者,手术是首选治疗方式,而中晚期患者只能依靠一些姑息治疗。由于肝脏本身是一种具有解毒及代谢功能的消化器官,因而对化疗也很不敏感。近年来,小分子抑制剂类药物的开发及使用也未能改变肝癌治疗的困窘,还给患者带来很大的经济负担。因此,为了减轻肝癌对人类健康的危害,对其复杂发病机理的全面深入研究,将任重而道远。近年来肿瘤相关的慢性炎症已被认为是肿瘤的第七大标志,肿瘤微环境中多种免疫细胞与肿瘤细胞相互影响以形成统一的适宜肿瘤生长的炎性微环境。其中,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境中最主要的一类天然免疫细胞,许多研究已证明TAMs可通过分泌多种细胞因子及介导T细胞免疫反应对肿瘤的生长、侵袭转移、血管生成等方面产生重要影响。因而,在肿瘤中晚期,其内部TAMs的浸润将加速肿瘤进展,大大阻碍治疗效果。鉴于巨噬细胞具有强大的起源及功能异质性,它们可根据微环境中的信号转变自身功能及角色。肿瘤中的巨噬细胞可被肿瘤细胞驯化,进而成为肿瘤进展的帮凶,因而研究肿瘤细胞与其周围浸润TAMs之间crosstalk的调控机制将有望阻断肿瘤对巨噬细胞功能及极化的影响,并有助于将促进肿瘤的巨噬细胞改造为抑制肿瘤进展的巨噬细胞。Wnt配体是一类以旁分泌形式传递细胞与细胞间信息的糖蛋白,可参与胚胎发育或成体发育阶段的细胞生长、迁移等生命活动。其异常表达也可导致多种疾病,例如肿瘤的发生。Wnt配体可由Wntless(WLS)这一细胞表面的跨膜转运体分泌至胞外,进而与FZDs及LRP5/6受体结合从而激活自身或邻近细胞内的Wnt/b-catenin信号。许多研究也表明肿瘤细胞,例如人乳腺癌、宫颈癌及非小细胞型肺癌细胞等均可高分泌Wnt配体。而肿瘤细胞是否可通过Wnt配体驯化巨噬细胞向TAMs转变至今还未见相关报道。【目的】已有研究报道Wnt信号可以影响造血细胞的分化过程,尤其对T细胞及树突细胞这类免疫细胞的发育有重要作用。提示Wnt信号可能还有进一步调控免疫反应的作用。我们的前期实验结果表明:Wnt/β-catenin信号在不同极化状态巨噬细胞中的表达存在显著差异性。接着,我们试图通过改变巨噬细胞中Wnt/β-catenin信号活化状态来研究其对巨噬细胞功能及极化的影响,并进一步探索这些改变将对肿瘤细胞的生物学行为产生何种作用。初步寻找肿瘤细胞与巨噬细胞之间crosstalk的可能方式。最后,计划在临床肝癌的手术标本中进一步验证,以期为临床肝癌的治疗提供一定基础研究依据。【方法】1.首先分选C57BL/6小鼠骨髓细胞中的CD11b+细胞,同时利用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)体外诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞,采用QRT-PCR方法分别检测CD11b+单核前体和CD11b+F4/80+巨噬细胞中Wnt/β-catenin通路下游基因表达差异,以观察Wnt/β-catenin信号对单核巨噬细胞分化的影响。其次,利用LPS+IFN-r与IL-4分别诱导M1及M2极化巨噬细胞,采用QRT-PCR方法对不同极化的巨噬细胞中Wnt配体、受体及下游基因的表达进行检测,根据检测结果进一步利用Western-Blot技术及免疫荧光细胞爬片进行反复验证。另外,通过构建小鼠原位肝癌模型,分选肿瘤内TAMs,进行极化相关分子表达以及Wnt/β-catenin通路下游基因表达情况的检测。2.选取C57BL/6小鼠体外MCSF诱导成功的骨髓来源巨噬细胞作为研究对象,对β-catenin低表达的M1型极化巨噬细胞进行Wnt3a激活Wnt/β-catenin通路的处理,观察对极化因子表达的影响。相反,对β-catenin高表达的M2型极化巨噬细胞进行ICG001抑制Wnt/β-catenin通路的处理,观察对极化因子表达的影响。在此部分实验中,采用QRT-PCR、免疫荧光细胞爬片、Western-blot以及流式细胞术胞内染色等多种技术方法反复验证。最后借助小干扰RNA技术通过沉默巨噬细胞Wnt/β-catenin通路下游靶分子c-Myc的表达,来研究Wnt/β-catenin信号对巨噬细胞极化的下游调控机制。3.采用小干扰RNA技术干涉巨噬细胞中β-catenin的表达,然后收集其经过IL-4极化刺激后的细胞培养上清,孵育肿瘤细胞或进行共培养实验观察巨噬细胞中β-catenin的表达降低后可对肿瘤细胞平板克隆形成能力、划痕愈合能力、侵袭转移能力有何影响。并进行混合淋巴细胞共培养实验检测巨噬细胞沉默β-catenin后对T淋巴细胞增殖能力的影响。4.为寻找肿瘤细胞对巨噬细胞驯化的可能机制。首先收取肿瘤细胞培养上清来孵育巨噬细胞,采用Western-Blot技术检测处理后巨噬细胞中Wnt/β-catenin通路下游分子β-catenin,c-Myc以及M2型极化相关分子的表达变化。另一方面,我们使用ICG001抑制剂与肿瘤上清同时孵育巨噬细胞,采用Western-Blot同样观察上述相关分子的表达变化。然后,利用慢病毒介导的sh RNA沉默技术,下调小鼠肝癌细胞hepa1-6中分泌Wnt配体的重要分子Wntless(WLS)后再次重复上述共孵育实验,以验证肿瘤细胞是否可通过分泌Wnt配体以激活巨噬细胞Wnt/β-catenin信号进而对其极化进行调控的猜想。最后,使用两种不同处理的hepa1-6细胞系(对照组:NC-hepa1-6及沉默组:sh-WLS-hepa1-6)构建小鼠原位肝癌模型,一方面观察肿瘤大小;另一方面利用免疫荧光,流式细胞术来分析肿瘤组织中的免疫细胞的变化情况,确认肿瘤细胞是否是通过分泌Wnt配体来调控巨噬细胞的极化。5.收集临床25例肝癌患者的手术切除标本,进行巨噬细胞(CD68),Wnt信号(β-catenin)和极化相关分子(MR/Arg-1)的免疫荧光染色,共聚焦显微镜拍照后对巨噬细胞中Wnt信号活化与极化相关分子表达进行定量和相关性分析。【结果】1.磁珠分选的骨髓CD11b+细胞纯度可达97%,体外诱导巨噬细胞成熟后纯度也达到95%以上。QRT-PCR结果显示单核向巨噬分化过程中Wnt/β-catenin信号下游分子表达水平是增加的。在不同极化状态的巨噬细胞中,M1、M2巨噬细胞均可表达一系列Wnt配体,但M2型巨噬细胞表达较高的受体FZD4,7,9,而受体在M1中表达均低于M0与M2。此外,QRT-PCR、Western-Blot和IF结果均显示Wnt/β-catenin信号下游分子Axin2,β-catenin,c-Myc在M2中表达最高,M1中表达最低。小鼠原位肝癌模型TAMs的QRT-PCR结果显示TAMs为M2-like表型,并且与正常肝脏枯否细胞(kuffer,KCs)相比Axin2,β-catenin,c-Myc表达显著增加。2.QRT-PCR结果显示使用Wnt3a处理后的M1型巨噬细胞,TNF-α、IL-12表达水平显著降低但同时IL-10、MR、Arg-1表达则增加;同样Wnt3a处理M2型巨噬细胞后,MR、Arg-1等表达也增加。而使用ICG001处理M2型巨噬细胞,IL-10、MR、Arg-1表达显著受到抑制。M2型巨噬细胞使用Wnt3a与ICG001处理后的免疫荧光结果与QRT-PCR结果一致。另一方面,QRT-PCR结果显示干扰c-Myc表达再进行IL-4极化,IL-10、MR、Arg-1等M2极化分子的表达相对于对照组降低,并且可抵消Wnt3a对其表达的促进作用。3.采用巨噬细胞条件性培养基孵育肿瘤细胞的平板克隆结果显示巨噬细胞沉默β-catenin组与对照组相比可抑制肿瘤细胞克隆形成能力。划痕实验结果也与其一致。在迁移侵袭的共培养实验中,沉默组较对照组均表现为对肿瘤侵袭能力有抑制作用。而混合T淋巴细胞培养实验中,结果显示巨噬细胞中沉默β-catenin后在M0及M2极化状态时均对T淋巴细胞的增殖有明显促进。4.利用肿瘤上清孵育巨噬细胞后可表现为促进M2型极化及激活Wnt/β-catenin信号的作用。而同时加入ICG001后,该作用被抑制。利用WLS沉默的肿瘤细胞上清孵育同样可减弱上述表型。sh-WLS-hepa1-6细胞接种小鼠肝癌模型中,免疫荧光显示肿瘤细胞Ki67染色与对照组相比减少;F4/80+MR/Arg-1的共染现象减少。肿瘤免疫微环境中TAMs的募集有一定减少,TAMs分泌IL-12增加,IL-10的分泌减少。并且T淋巴细胞的浸润在沉默组是增加的,而Treg浸润比例则减少。5.临床肝癌患者手术病理标本免疫荧光染色结果为CD68+β-catenin+MR/Arg-1有一定比例的共染现象。并且平均荧光强度的统计结果提示CD68+细胞中β-catenin与MR或Arg-1的平均荧光强度呈正相关关系。【结论】1.Wnt/β-catenin不仅参与单核巨噬分化成熟的过程而且还可参与巨噬细胞极化的调控,表现为促进M2型极化而抑制M1型极化。Wnt/β-catenin可通过下游效应分子c-Myc促进巨噬细胞M2型极化。本研究初步揭示了一种调控巨噬细胞分化及极化的新机制。2.抑制巨噬细胞中Wnt/β-catenin信号通路会影响肿瘤细胞克隆形成,划痕愈合及侵袭转移的恶性生物学能力。并且抑制巨噬细胞中Wnt/β-catenin表达可提高巨噬细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力,有利于形成抑制肿瘤发展的免疫微环境。为临床寻找肝癌生物免疫治疗的新靶点提供了理论基础及实验依据。3.肿瘤细胞可能通过分泌Wnt配体来激活巨噬细胞中的Wnt/β-catenin信号通路,进而促进其向M2型极化转变并可减少T淋巴细胞的浸润和招募Treg细胞等免疫抑制细胞促进肿瘤恶性生长。本研究提出肿瘤细胞通过分泌Wnt配体激活肿瘤相关巨噬细胞中Wnt/?-cateninh信号途径进而调控M2型巨噬细胞极化的新机制。