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研究背景:肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerasis,ALS）是一种主要损伤人类的大脑皮层、脑干和脊髓运动神经元的神经性退行性疾病。这些部位的运动神经元受到损伤时,它们会失去与肌肉或者腺体的连接,控制的肌肉出现肌束震颤,导致肌肉自发性抽搐,最终出现萎缩。肌萎缩侧索硬化症发病通常始于四肢,多在确认患病的35年内死于呼吸系统衰竭。临床上根据其病理将肌萎缩侧索硬化症分为散发性肌萎缩侧索硬化症（Sporadic Amyotrophic lateral sclerosis,SALS）和家族性肌萎缩侧索硬化症（Family Amyotrophic lateral sclera-sis,FALS）两种类型,其中家族型肌萎缩侧索硬化症（FALS）约占所有ALS的10%左右,遗传方式多数为常染色体显性遗传,少数是X连锁或常染色体隐性遗传。目前对于ALS的致病机理仍然不是很清楚,临床上也缺乏有效的治疗手段,唯一有效的药物-力如太,也只能提高病人的生活质量,延长3个月左右的寿命。近年来,很多ALS的疾病模型被建立,其中主要包括果蝇、啮齿类和猪等模型,这些模型在一定程度上解决一部分的机理问题,但是由于种属的差异,很多临床病人的病理特征很难在这些动物上并没有检测,同时在这些动物模型上筛选的药物及发病机理很难在病人身上适用,由于非人灵长类在遗传背景和基因组学上与人类相似性高,故对于人类医学研究与基础性发育研究都具有极高的参考意义,现在已作为理想的模式动物模型来探究ALS的发病机制和治疗。本研究选取了亚洲人发病率较高的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD1）为研究基因,利用点突变技术得到人的突变型的SOD1(hSOD1G93A),将突变型mSOD1(hSOD1G93A)连接到以泛素（UBI）为启动子的pFUW慢病毒载体中,构建包含hSOD1G93A基因的转基因载体,即pLVU-SOD1G93A突变质粒。在猴胚胎时期注射携带突变基因的慢病毒,后续进行胚胎移植,最终得到6只成功插入突变基因的hSOD1G93A转基因猴。经过分子表型检测,在DNA、mRNA证实突变基因的插入和拷贝数的情况,其中3只转基因猴插入的拷贝大于4。建立了6只转基因猴的成纤维细胞系,成纤维细胞的免疫荧光和免疫蛋白印迹均证实在转基因猴的血液和成纤维细胞的均有突变蛋白表达。建立了6只转基因猴iPSC向神经干细胞与运动神经元的定向分化体系,得到了高比例的成熟神经干细胞与运动神经元,这些细胞的获得为后续机理探究以及治疗奠定了基础。研究目的:1、利用慢病毒携带突变型hSOD1G93A基因,在猴胚胎时期注射携病毒,获得肌萎缩侧索硬化症的疾病模型猴。2、利用分子检测手段,检测转基因猴的hSOD1G93A基因插入与表达情况。3、转基因猴的组织建系获得成纤维细胞系,将成纤维细胞重编程,得到其诱导多功能干细胞;将干细胞进行诱导分化,神经干细胞与运动神经元,为下一步探究致病机理和干细胞移植治疗奠定基础。研究方法:1、构建点突变hSOD1G93A的质粒,将其连接到以泛素（UBI）为启动子的pFUW慢病毒载体中,即pLVU-SOD1G93A突变质粒。在猴胚胎水平进行注射,待其发育到囊胚时期进行胚胎移植,得到新生小猴。2、通过分子检测手段,在hSOD1G93A转基因猴的DNA,mRNA,蛋白质水平,分别鉴定突变基因的插入和转录翻译的表达情况。3、获得转基因猴的成纤维细胞,利用携带四种转录因子（SOX2、OCT4、Klf4、c-Myc）的仙台病毒进行成纤维细胞重编程,得到诱导多功能干细胞。将不同小分子组合,使诱导多功能干细胞定向分化为诱导多功能干细胞、神经干细胞与运动神经元。研究结果:本研究基于慢病毒携带突变型hSOD1G93A基因,在猴胚胎水平进行注射,待其发育到囊胚时期阶段进行胚胎移植,获得新生小猴。运用PCR、QPCR、Western blot、细胞免疫荧光、电生理及行为学系统性的研究hSOD1G93A转基因食蟹猴的患病情况,结果如下:本研究首次成功建立了6只插入hSOD1G93A的食蟹猴,在6只转基因猴的DNA与mRNA均可看突变基因hSOD1G93A的成功插入,同时发现其中3只插入拷贝数大于4;检测转基因猴成纤维细胞与血液的总RNA,发现DNA中插入拷贝数相对多的的转基因猴,总RNA的表达水平相对高。利用免疫荧光和蛋白质印迹法（Western Bloting）检测血液和成纤维细胞中蛋白的表达水平,发现插入突变基因的蛋白表达水平、插入拷贝数与mRNA表达水平正相关。转基因食蟹猴肌肉电生理与动物行为的力量检测,观察到部分转基因猴出现自发电位与肌肉萎缩的情况,这与分子表型检测结果相对应。通过转基因猴的组织建系分别获得其成纤维细胞,将成纤维细胞重编程,得到其诱导多功能干细胞、神经干细胞和运动神经元。结论:1、利用慢病毒获得到hSOD1G93A过表达的6只转基因猴,其中3只在DNA和mRNA均有较高的表达量表达。部分转基因猴的自发电位部位由少变多,首个转基因hSOD1G93A的建立,为ALS临床症状的的探究奠定了基础2、获得了6只猴的成纤维细胞和iPSC、NSC和MN,为探究细胞移植治疗的稳定性和有效性提供了参考。3、建立了成熟的运动神经元的分化体系,诱导多能干细胞定向诱导中,得到了90%以上的成熟运动神经元,为其他神经退行性疾病模型的分化提供参考。