结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）引起的一种人兽共患的慢性传染性疾病。结核分枝杆菌主要侵犯人体肺脏,呼吸道传染是本病的主要传染方式。目前为止,临床上针对结核病的疫苗仅有卡介苗（BCG）,但卡介苗的保护效果不均一,对成年人的免疫效果也不明确,再次接种后不但不能起到提高机体免疫保护的作用,反而有可能激发潜伏性感染。所以迫切需要研发更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病。本试验以Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D蛋白基因为靶点构建重组卡介苗,并对其免疫保护效果进行评价。本试验以实验室保存的Mtb基因组DNA为模板,PCR扩增Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D蛋白基因片段,胶回收后对其进行测序和序列比对,而后通过In-Fusion Cloning方法克隆至p MV261载体中,经酶切及PCR方法鉴定正确后,将上述4种重组质粒电转至BCG感受态细胞中。经Western Blot检测重组卡介苗中Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D蛋白His标签的表达情况。结果显示,重组卡介苗中可正确表达转入的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白,大小与预期蛋白分子量一致。表明4株重组卡介苗构建成功,将其分别命名为r BCG/Ag85A、r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C、r BCG/Ag85D。对4株重组卡介苗进行免疫效果评价,将C57BL/6小鼠随机分为六组,每组12只。分别为PBS对照组、BCG组、r BCG/Ag85A组、r BCG/Ag85B组、r BCG/Ag85C组和r BCG/Ag85D组。经颈背部皮下免疫,PBS组0.1 m L/只,其他疫苗组免疫剂量均为每只10⁶CFU/0.1 m L。免疫4周后,每组随机选择6只小鼠眼球采血处死。利用小鼠免疫球蛋白检测试剂盒检测小鼠血清中Ig G、Ig M抗体浓度,结果表明BCG、r BCG/Ag85A、r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C、r BCG/Ag85D均可刺激小鼠产生良好的体液免疫应答,其中r BCG/Ag85D组小鼠体内Ig M水平显著高于BCG组,提示r BCG/Ag85D免疫后有利于在小鼠感染初期提高机体的体液免疫水平。利用ELISpot试剂盒和流式细胞术方法检测小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数以及小鼠脾淋巴细胞中产生IFN-γ的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分别占总CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比例。结果显示,在结核菌素（PPD）刺激下,r BCG/Ag85B组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ数量显著高于BCG组（P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示:r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C两组表达IFN-γ的CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞占总CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞比例均显著高于BCG组及其他免疫组（P<0.01）。表明重组卡介苗r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C能够更好地诱发机体产生特异性细胞免疫应答。免疫4周后,对各免疫组小鼠进行结核分枝杆菌H37Rv株的感染,感染方式为尾静脉注射,剂量为10⁶CFU/0.1 m L/只。感染后对各组小鼠的体重及精神状态进行监测,每周一次。并于感染4周后将小鼠处死,无菌采集小鼠肺脏、脾脏,进行组织内细菌负荷计数（CFU）和组织病理切片观察。结果显示,r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C组小鼠在感染后体重仍稳步增长;与BCG组及PBS对照组相比,肺脏（脾脏）CFU分别减少0.9～1.1 log₁₀(1.1～1.4 log₁₀)及2.4～2.7log₁₀(2.2～2.5 log₁₀)。r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C免疫组小鼠肺组织病理切片仅观察到极少量淋巴细胞浸润和轻度炎症损害,无上皮样结节,肺损伤率分别为9%和8%,而BCG及PBS对照组肺损伤率为37%和22%。表明重组卡介苗r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C免疫可使小鼠获得较优于BCG组的免疫保护效果。本试验成功构建了4株重组卡介苗,其中r BCG/Ag85B、r BCG/Ag85C两株重组卡介苗均能够诱导小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,可有效的抑制Mtb H37Rv株在小鼠肺脏和脾脏组织中的增殖,对小鼠感染Mtb具有明显的保护作用。为重组卡介苗的研究和应用提供了重要的数据支持,并为后续疫苗的应用奠定基础。