腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase,ADA)为机体重要的核酸分解代谢酶,其活性的检测对于结核、恶性肿瘤、中枢神经系统疾病、肝病和伤寒等的诊断与鉴别诊断具有重要意义,其总检测数在我国已开展的1000多项检验项目中排名96位。然而,目前ADA活性的测量方法众多,即便同一种方法也存在多种试剂配方,而酶活性检测的特殊性就在于其检测结果与反应条件密切相关,因此造成同一标本在各医院检验科检测得到的ADA活性结果差别较大,而各实验室多采用同样的参考区间,这就给临床诊疗以及检验结果的互认带来了困惑和障碍。而造成这种局面的真正原因就是缺少一个公认的,各检测方法结果能够向其溯源的方法,即ADA的参考系统。本课题拟建立ADA活性检测的参考方法,制备ADA的参考物质,建立ADA参考区间,最终形成一套完整的参考体系,为临床ADA检测的标准化和一致化打下基础。第一章腺苷脱氨酶候选参考方法的研究目的:建立性能符合要求的ADA候选参考方法。方法:1.查阅国内外相关文献,了解ADA在临床中的应用及检测方法。2.腺苷脱氨酶优化方法的选择:首先对国内外ADA众多检测方法进行文献研究,对各方法性能进行比较分析,其次通过实验评价ADA酶偶联两步和四步法部分性能。3.试剂的配制要求:环境要求、称量要求和实验用水要求参照参考方法的要求。4.仪器校准:实验进行前对所用到的紫外分光光度计、稀释配液仪、pH计、电子天平、温度计、移液器、玻璃仪器等均进行常规校准,校准程序按照参考实验室标准操作规程(SOP)文件进行。5.检测条件的探讨与优化:包括环境温湿度、检测温度、检测波长、波宽、光径、孵育时间、延迟时间、检测时间、检测点等。6.反应体系的优化:包括反应体系pH和各反应物浓度。先用单因素固定筛选方法确定每个影响因素的合适实验区间。其次筛选对实验影响显著的因子,最后运用响应曲面优化方法(response-surface)将实验中的多个因素与指标的相互关系用多项式近似拟合,依此对函数的响应面进行分析,从而计算各反应因素的最优值。7.对建立的ADA候选参考方法的缓冲体系pH,三个工具酶检测方法等进行优化。8.性能评价:根据CLSI系列文件EP5-A2/EP6-A/EP7-A对建立的ADA候选参考方法的性能进行评价,包括精密度、线性、正确度、抗干扰能力等。其中在干扰实验中,评定了甘油三酯、血红蛋白、总胆红素、维生素C、治疗肝脏疾病的中药代谢单体甘草次酸、脱氧胆酸和黄芩素对方法的干扰。9.不确定度评定:根据参考文献和相关标准,对所建立的ADA候选参考方法进行不确定度评定,包括A类和B类不确定度,A类不确定度来源于实验(重复因素),通过实验设计参数的变化梯度进行检测,从而计算该参数的灵敏系数(对不确定度的贡献系数),进行评定;B类不确定度来源于证书(校准因素),通过查阅校准证书获得,最后将实验中所有的不确定度进行合成,扩展因子K=2(取95%置信区间)。结果:1.通过对ADA检测方法的文献研究,选取酶偶联两步法和四步法进行实验研究。2.ADA酶偶联两步法试剂空白均值为1.4 U/L,标准差0.4 U/L;5个不同浓度的样本空白(单位:U/L)分别为:7.8,9.0,11.5,9.3,10.2;精密度:2水平样本每天检测3次连续检测5天的均值为20.1 U/L和35.6 U/L,标准差为1.2 U/L和0.8 U/L,变异系数为6.0%和2.3%;线性范围方程为Y=32.615X-19.2214((R2=0.9973),高限为207.7 U/L。四步法试剂空白均值为0.6 U/L;标准差:0.6 U/L;5个不同浓度的样本空白(单位:U/L)分别为:0.1,-0.3,0.5,0.9,-0.4;精密度:2水平样本每天检测3次连续检测5天的均值为31.1 U/L和49.2 U/L,标准差均为0.4 U/L;变异系数:1.1%和0.8%;线性范围方程为Y=38.8179X-30.9571(R2=0.9993),检测高限为240.2 U/L。3.腺苷脱氨酶(ADA)的候选参考方法检测条件为:检测温度为37 ℃±0.1 ℃;检测波长:550 ± 1nm;波宽为10 mm ± 0.01 mm,光径≤ 2 nm,检测点≥6;孵育时间5min,延迟时间120s,监测时间180s。4.腺苷脱氨酶(ADA)的候选参考方法的显著影响因子为:底物腺苷(Adenosine),工具酶黄嘌呤氧化酶(XOD),4-氨基安替吡啉(4-AA),磷酸氢二钠(Na2HPO4)四个因子。5.试剂(终)浓度(四个显著因子):腺苷 4.0mmol/L;XOD 3224.2U/L;Na2HPO4 0.96 g/L;4-AA 1.2 mmol/L。6.方法性能:批内精密度:两样本(检测均值分别为:31.2 U/L和80.9 U/L)变异系数均为0.4%;期间精密度:样本1变异系数为1.8%,样本2为0.8%。线性范围:0.3-286.5 U/L。正确度:ADA候选参考方法检测标准物质BCR-647(IRMM)均值:194.1 U/L,标准差:0.5U/L,变异系数为0.2%,超出给定靶值(153.0±5.4U/L)约40个单位。抗干扰能力:甘油三酯≤ 3.39 mmol/L,血红蛋白≤3.75 g/L,总胆红素≤85.5 umol/L,维生素C≤40mg/L,甘草次酸和脱氧胆酸≤20mg/L,黄芩素≤37.5mg/L时对方法无干扰。7.ADA候选参考方法的不确定度评定结果:A类不确定度评定参数包括检测温度,检测波长,反应体系pH,反应液总体积,样本体积,样本测量等,灵敏系数分别为4.4%,0.5%,1.04%,1.0,1.0,1.0;B类包括复溶(天平称量),比色杯,吸光度等,灵敏系数均为1.0。最后合成的扩展不确定度在31 U/L水平为0.59 U/L。结论:1.酶偶联两步法和四步法各有优劣,但两步法致命的缺点是内外源氨污染无法消除,相较四步法没有其反应稳定,所以选取酶偶联四步法作为ADA候选参考方法优化建立的基础。2.所建立的ADA候选参考方法精密度较好,线性范围满足临床需要,与其他方法相比检测灵敏度提高,抗干扰能力较强,具有较小的不确定度,性能符合要求。ADA候选参考方法已建立完成,可为临床其他参考方法的建立提供参考。3.响应曲面方法在ADA候选参考方法建立优化实验中发挥很大作用,是一种很好的优化方法,可应用于临床检验其他方法的优化研究。第二章 腺苷脱氨酶参考物质的研究目的:制备互通性较好的血清基质的腺苷脱氨酶参考物质。方法:1.自Pubmed基因库里查阅获得人ADA基因序列。2.构建 3 种原核克隆载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA)和1种真核克隆载体(GS115+pPICZαA+ADA)诱导表达目的蛋白。3.ADA蛋白诱导表达后经Western-blot技术定性,半定量,比较各载体蛋白表达量及酶可溶性,并进行酶活性分析。选择最优表达系统大量表达目的蛋白,经纯化后,分析其纯度,酶活性和蛋白定量。4.收集本院体检者,体检结果正常的新鲜血清,作为参考物质的基质。将纯化好的ADA蛋白添加到收集的血清基质中,制备两水平参考物质,充分混匀后分装于冻存管中,密封冻存于-80℃。5.对所制备的ADA两水平参考物质根据CNAS-GL03文件对其均匀性(方差分析)和稳定性[t-检验和临床意义(均匀性均值±2.5%范围)]进行评定。6.用建立的候选参考方法为所制备的ADA两水平参考物质定值,定值结果用“靶值±不确定度”表示。结果:1.构建的腺苷脱氨酶的三个原核表达载体表达蛋白活性(纯化后)最高为89 U/L,一个真核表达载体表达蛋白活性(纯化后)最高为4200 U/L。2.制备的ADA两水平参考物质性能评价结果:均匀性:水平1检测均值为26.3 U/L,方差分析P=0.231(>0.05),水平2检测均值为225.7 U/L,方差分析P=0.313(>0.05);稳定性:室温放置稳定5h;4-8℃放置稳定12h;-20℃放置稳定15天;目前-80℃样本放置时间为3个月,检测结果稳定。3.制备的ADA两水平参考物质由候选参考方法赋值结果(均值±不确定度)为:水平1:26.0±0.9U/L;水平2:219.1±3.4U/L。结论:制备的腺苷脱氨酶两水平参考物质由候选参考方法赋值,均匀性符合要求,稳定性好。本实验成功研制了ADA参考物质,同时可为其他参考物质的研究提供参考。第三章腺苷脱氨酶参考区间的建立目的:基于建立的ADA候选参考方法,建立广东地区健康成年人ADA参考区间。方法:1.参考CLSI CA28-A3《临床实验室如何定义、建立和确定生物参考区间(核准指南-第三版)》文件和相关文献以及ADA的临床意义制定相应的纳入标准和排除标准。2.筛选符合ADA参考区间纳入标准的个体通过知情同意后,于早7:00-10:00之间空腹采集静脉血2ml于分离胶管分离血清备用。3.实验室检测:ADA检测使用迈瑞生化分析仪和参考方法的试剂在质控在控等条件下检测;其他排除标准的检测项目使用本院检验科临床检测系统Roche Modular PPI,按照日常工作规范进行检测,继而按照排除标准排除实验室检测结果不在参考区间内的个体。4.统计分析:根据D/R(1/3)规则和/或Q1,Q3规则去除离群值;运用Z检验方法分析是否根据性别,年龄等因素进行分组;最后建立α =0.05水平的参考区间以及计算参考限的90%置信区间。结果:1.入选个体:从广东地区1662名志愿个体中,最终筛选出650例个体(男296例,女354例)的检测结果进行统计分析。2.离群值:去除1例。3.分组结果:性别分组Z值为3.0,Z*为4.9,Z小于Z*,不分组;年龄段分组,Z值为7.8,Z*为4.9,Z大于Z*,分组有统计学意义,但无临床意义,综合考虑不分组。4.广东地区健康成年人(18-79周岁)腺苷脱氨酶候选参考方法参考区间:0-31 U/L,高限的90%置信区间为:30.5-31.1 U/L。结论:基于ADA候选参考方法的基础上,建立了广东地区健康成年人ADA的参考区间,为临床实验室ADA检测标准化和一致化提供基础。第四章ADA候选参考方法的临床应用目的:用建立的ADA候选参考方法评价常规方法的准确性。方法:临床常规检测系统Y1(Roche Modular PPI检测系统+迈克ADA检测试剂盒)和基于参考方法的自建临床常规检测系统Y2(迈瑞分析仪+自配试剂),按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)EP9-A2文件和建立的参考区间范围收集样本,与参考方法(X)进行比对试验研究。设定ADA临床可接受偏移为1/2允许总误差水平(±15%)。结果:临床检测系统Y1与参考方法(X)比对拟合的方程为:Y1 = 0.6326X-2.2629(R2=0.9517);失拟性P=0.054(>0.05),Y1与参考方法的平均偏移为:-45.7%,在医学重要水平处(30 U/L,200 U/L)的偏移分别为:-44.3%和-37.9%;自建临床系统Y2与参考方法(X)比对拟合的方程为:Y2 = 1.0280X-1.6211(R2=0.9977),失拟性P=0.565(>0.05),Y2与参考方法的平均偏移为:-3.7%,在医学重要水平处(30U/L,200 U/L)的偏移分别为:-2.6%和2.0%。结论:两临床检测系统与参考方法的相关性较好。但临床检测系统Y1与候选参考方法不可比,临床检测系统Y2与候选参考方法可比。参考方法是评估常规方法的有效工具。