背景与目的:肠上皮细胞是排列于肠道的单层上皮细胞,隔绝外界环境影响,保护机体内稳态的重要器官。它的功能主要包括营养物质的吸收和防御外界侵袭的防御功能。肠道的吸收功能维持身体所必须的营养物质包括糖,脂肪,蛋白质,氨基酸,维生素和微量元素等。肠道的防御功能是以屏障的防御功能为主,主要由四个部分构成即化学屏障、生物屏障、免疫屏障和机械屏障[1-4]。其中机械和免疫屏障之间存在相互调控进而增强了屏障的防御功能,维持肠道内环境稳态的核心。炎症性肠病(IBD)、全胃肠外营养(TPN)、内毒素、烧伤、战创伤和手术应激等病理条件下均可导致肠屏障功能障碍,破坏屏障的完整性,增加肠道通透性,引发肠源性感染,导致原发疾病加重,最终诱发机体损伤,导致多器官功能衰竭[4]。固有免疫系统在一线防御中起到重要作用[5],其主要包括上皮屏障(皮肤,粘膜上皮),可溶性分子(抗菌肽,补体,细胞因子和天然抗体),吞噬细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)和膜式识别受体(TLRs、NLRs、清道夫受体和C型凝集素受体)。甘露糖结合凝集素(Mannose binding lectin,MBL)作为固有免疫的重要成分。其属于凝集素超家族成员之一。其功能结构域主要由糖基识别位点和胶原样位点构成。其中糖基位点(carbohydrate recognition domain,CRD)可以识别微生物并,再通过胶原样位点(collagen like domain,CLD)与MBL相关蛋白酶(MBL-associated serine proteases,MASPs)形成复合物进而激活下游的补体途径。此外,MBL还可以识别细胞上的受体并与吞噬细胞结合,发挥吞噬清除功能。在过去十年的研究中显示MBL与肠粘膜屏障密切相关,如在急性IBD模型中,MBL基因缺陷小鼠的肠道粘膜损伤较重,并且死亡率较高,而补体C3基因缺陷小鼠的肠道损伤较轻。同时在细菌侵入肠道研究中,发现MBL可以与细菌直接结合并清除,减少炎症因子的释放,从而保护肠粘膜屏障[5,6]。上述研究主要围绕MBL的补体激活功能,而MBL的非补体功能研究较少,因此本实验主要探讨MBL的非补体依赖功能。本课题拟在体内体外模型中,应用免疫印记、real-time PCR、免疫荧光、跨上皮电阻测定等技术,探讨内毒素条件下MBL通过何种方式参与调控肠屏障功能,并探讨其中作用机制,为MBL缺陷患者肠道保护提供新思路。方法:1.建立小鼠内毒素血症模型,应用免疫荧光、HE染色、Ussing Chamer技术,观察肠粘膜损伤情况。2.围绕内毒素模型,应用免疫组化,荧光定量PCR,免疫印迹法等技术,观察内毒素刺激后MBL表达情况。3.通过构建MBL干扰质粒,应用免疫印迹法,荧光定量PCR,免疫荧光,TER等技术,观察肠上皮屏障功能的变化情况。4.体外Caco-2细胞上用MBL刺激后,检测上皮细胞损伤以及屏障功能变化情况,明确MBL对屏障的影响。主要结果:1.LPS处理后,肠粘膜正常形态学改变,绒毛断裂、水肿,上皮细胞脱落,粘膜通透性增加,肠粘膜细胞凋亡增加。2.LPS处理后,体内和体外MBL增多,通过免疫组化发现MBL定位在肠上皮细胞内。3.体外干扰MBL后,观察上皮细胞间的紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin较正常组降低,细胞间紧密连接结构受损,完整性差,连接中断。并且通透性实验(TER)显示肠通透性增加。低浓度重组MBL处理Caco-2细胞后,上皮细胞凋亡增加不明显,TJ蛋白表达升高,屏障通透性降低,而高浓度的重组MBL组凋亡明显增加结论1.LPS处理肠上皮细胞后,屏障通透性增加,结构受到破坏,凋亡增加,上皮表达MBL增多。同样在体外LPS处理肠上皮细胞后MBL表达也增多,提示MBL的表达可能在调节肠屏障功能中起到重要作用。2.体外干扰MBL基因后,紧密连接蛋白表达减少,蛋白结构改变,肠粘膜通透性增加,表明MBL可能是参与紧密连接蛋白形成的调控进而调节肠粘膜屏障功能。而低浓度的重组MBL蛋白可以促进TJ蛋白的表达,起到保护屏障功能。