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研究背景缺血性心脏病常发生心肌缺血,再供血后损伤加重,称为心肌缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤。心肌I/R损伤多见于经皮冠脉介入术、心脏瓣膜手术和心内直视手术等治疗,造成心肌梗死、心律失常、心力衰竭和心肌细胞死亡等,严重影响患者的康复。近年来,围手术期心肌保护受到重点关注,因此探索防治心肌I/R损伤的机制,在临床麻醉中具有重要意义。铁死亡（Ferroptosis）是心肌I/R损伤中细胞的重要死亡方式,阻抑心肌细胞铁死亡可以减少心肌I/R损伤。在脂氧合酶或Fe2+的作用下,脂质过氧化和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）增多导致细胞铁死亡。铁死亡的特征是线粒体萎缩、嵴减少和外膜破裂等。当心肌细胞受到缺血缺氧刺激时,P53的活性增强并进入细胞核调节下游蛋白的表达,促进铁死亡的发展。因此,如何抑制P53活性进而抑制心肌细胞铁死亡,成为减轻心肌I/R损伤的关键。丙泊酚的结构与维生素E类似,具有较强的抗氧化作用。通过促进抗氧化酶的表达,丙泊酚抑制ROS产生和脂质过氧化,减轻心肌I/R损伤。细胞ROS过度产生和脂质过氧化,是铁死亡发生的重要因素。因此,丙泊酚可能通过抑制心肌细胞铁死亡,发挥心肌保护作用。丙泊酚抑制心肌I/R损伤中P53的活性,但其机制尚不明确。P53活性受蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB/AKT）的负调节,磷酸化的AKT促进鼠双微基因2（Murine double minute 2,MDM2）与P53结合,诱发P53分解从而抑制细胞铁死亡。已证实丙泊酚通过调控AKT/P53信号通路,抑制大鼠肝脏I/R损伤。丙泊酚是否通过抑制心肌细胞铁死亡,减轻心肌I/R损伤?AKT/P53信号通路是否在丙泊酚抑制心肌细胞铁死亡中起作用?迄今未被研究。本课题组提出假设:丙泊酚通过抑制心肌细胞铁死亡,减轻心肌I/R损伤,上述机制与AKT/P53信号通路有关,为验证该假说,本课题组设计了相关实验。第一部分:丙泊酚通过抑制心肌细胞铁死亡以减轻心肌缺血再灌注损伤研究目的1.观测细胞铁死亡在丙泊酚减轻H9C2细胞损伤的作用。2.探讨细胞铁死亡在丙泊酚减轻大鼠心肌I/R损伤中的作用。研究方法1.H9C2细胞常规培养和传代。2.细胞分组,用过氧化氢（H2O2）和伊拉斯汀（Erastin,铁死亡诱导剂）建模（图1-1A）:（1）C组:常规培养25h。（2）H组:常规培养60min,加入200μMH2O2刺激24h。（3）H+P组:加入50μM丙泊酚刺激60min和200μMH2O2刺激24h。（4）E组:常规培养60min,加入2.5μM Erastin刺激24h。（5）E+P组:加入50μM丙泊酚刺激60min和2.5μM Erastin刺激24h。3.使用相差显微镜观察、台盼蓝染色和CCK-8实验,检测细胞活力（图1-2）。4.通过流式细胞术和荧光染色,检测细胞ROS含量。5.使用免疫荧光,评估细胞核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,NRF2）核转位水平。6.通过试剂盒检测细胞丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性和亚铁含量。7.建立大鼠离体心脏Langendorff模型,分组（图1-1B）:（1）C组:灌注KH溶液120min。（2）I/R组:灌注KH溶液30min,停止灌注30min和再灌注60min。（3）I/R+P组:灌注KH溶液10min和50μM丙泊酚20min,停止灌注和再灌注。8.通过试剂盒测定心肌乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、SOD活性、肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzymes,CK-MB）的含量、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（Reduced glutathione/Oxidized glutathione,GSH/GSSG）比值、MDA和亚铁含量（图1-3）。9.使用氯化三苯基四氮唑（Triphenyl tetrazolium chloride,TTC）、HE染色和透视电镜评估心肌梗死面积、病理和线粒体情况。10.采用免疫组化测定心肌NRF2核转位情况。11.通过Western blot评估H9C2细胞和心肌NRF2、血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）、铁蛋白重链（Ferritinheavy chain 1,FTH1）、谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）和胱氨酸/谷氨酸反向转运体（Cystine/glutamate reverse transport body,XCT）表达。结果1.与对照组相比,H2O2导致细胞活力降低和活性氧增多;丙泊酚使用后,细胞活力和活性氧较H组回落。2.H2O2引起NRF2核转位和HO-1表达较对照组轻度增多;丙泊酚应用后,NRF2核转位和HO-1较H组显著增多。3.与对照组比较,Erastin引起细胞活力降低和超氧阴离子增多;丙泊酚预处理后,细胞活力和超氧阴离子较E组缓解。4.与对照组相比,Erastin导致MDA和亚铁含量增多,SOD活力和抗铁死亡酶表达降低;丙泊酚应用后,MDA、亚铁含量、SOD活力和抗铁死亡酶均回落。5.与正常心肌比较,I/R引起LDH、CK-MB、MDA和亚铁含量增多,SOD活力和GSH/GSSG 比值降低;与I/R组比较,丙泊酚治疗后LDH、CK-MB、MDA和亚铁含量降低,SOD活力和GSH/GSSG 比值增多。6.I/R诱导较正常心肌梗死面积增加、纤维水肿和线粒体嵴扭曲;与I/R组相比,丙泊酚治疗后心肌梗死面积减少、纤维水肿减轻和线粒体嵴规整。7.I/R处理后,NRF2核转位和HO-1较正常心肌轻度增加;丙泊酚预处理后NRF2核转位和HO-1较I/R组显著增加。8.与正常心肌比较,I/R引起抗铁死亡酶表达减少;丙泊酚使用后,抗铁死亡酶表达较I/R组显著增加。结论1.丙泊酚抑制H9C2细胞铁死亡。2.丙泊酚抑制心肌细胞铁死亡以减轻心肌I/R损伤。第二部分:丙泊酚调控AKT/P53通路抑制铁死亡减轻心肌缺血再灌注损伤研究目的1.探讨丙泊酚对AKT基因敲除的H9C2细胞铁死亡的影响。2.探究丙泊酚是否通过调控AKT/P53信号通路、抑制心肌细胞铁死亡以减轻心肌I/R损伤。研究方法1.H9C2细胞常规培养和传代。2.细胞分组（图2-1A）:（1）C组:常规培养25h。（2）E 组:常规培养 60min,加入 2.5μM Erastin 刺激 24h。（3）E+P组:加入50μM丙泊酚刺激60min和2.5μM Erastin刺激24h。3.使用相差显微镜观察、台盼蓝染色和CCK-8实验,检测细胞活力（图2-2）。4.通过Western blot和CCK-8实验,评估丙泊酚对于AKT siRNA和Erastin处理的H9C2细胞,AKT、P-AKT、抗铁死亡酶（FTH1、GPX4、XCT）和细胞活力的影响。5.建立大鼠离体心脏Langendorff模型,使用AKT抑制剂MK2206,分组（图2-1B）:（1）C组:灌注KH溶液120min。（2）I/R组:灌注KH溶液30min,停止灌注30min和再灌注60min。（3）I/R+P组:灌注KH溶液10min和50μM丙泊酚20min,停止灌注和再灌注。（4）I/R+P+MK:灌注 15nM MK2206 10min 和 50μM丙泊酚 20min,停止灌注和再灌注。（5）I/R+MK:灌注 15nM MK2206 10min 和 KH 溶液 20min,停止灌注和再灌注。6.通过试剂盒检测心肌GSH/GSSG比值和亚铁含量（图2-3）。7.使用HE染色和透视电镜测定心肌病理和线粒体情况。8.通过Western blot测定心肌抗铁死亡酶和P53表达。9.使用Western blot和免疫荧光评估心肌AKT和P-AKT表达。结果1.与Scramble siRNA组比较,AKT siRNA组AKT、P-AKT及抗铁死亡酶的表达和细胞活力降低;与Scramble siRNA E组相比,AKT siRNA E组抗铁死亡酶表达和细胞活力轻度降低;与Scramble siRNA E+P组相比,AKT siRNA E+P组抗铁死亡酶表达和细胞活力轻度降低。2.I/R处理与对照相比,GSH/GSSG 比值降低和亚铁含量增多;与I/R组和I/R+MK组比较,丙泊酚预处理分别提高GSH/GSSG 比值和降低亚铁含量。3.与对照组相比,I/R组引起心肌纤维水肿、波浪状改变和线粒体嵴扭曲;与I/R组和I/R+MK组相比,丙泊酚处理分别减轻心肌纤维水肿和波浪状变化、促进线粒体嵴规整。4.I/R处理与对照组相比,抗铁死亡酶表达增多和P53表达降低;与I/R组和I/R+MK组比较,丙泊酚处理分别增加抗铁死亡酶表达和降低P53表达。5.与对照组比较,I/R组P-AKT表达降低;与I/R组和I/R+MK组比较,丙泊酚处理均促进P-AKT的表达;各组AKT表达没有差异。结论1.丙泊酚影响AKT信号通路抑制H9C2细胞铁死亡。2.丙泊酚调控AKT/P53信号通路抑制心肌细胞铁死亡,减轻心肌I/R损伤。全文结论丙泊酚调控AKT/P53通路抑制铁死亡减轻心肌I/R损伤。创新性和意义1.首次发现丙泊酚抑制心肌细胞铁死亡。2.首次发现丙泊酚调控AKT/P53信号通路抑制心肌细胞铁死亡,减轻心肌I/R损伤。局限性1.未探讨丙泊酚心肌保护效应的浓度依赖性变化。2.未检测其他抗铁死亡酶的表达。