家蝇三龄幼虫是一种传统中药材,药名“五谷虫”,俗名“蛆”。本课题组在前期工作中,将家蝇三龄幼虫血淋巴部分制备成干粉,幼虫壳制成壳聚糖,两者进行组合混匀,制成粉末状家蝇蛆粉,发现该家蝇蛆粉对大鼠高血脂及动脉粥样硬化具有防治作用,比例为10:1组合时效果最佳。本文拟以昆明小鼠和Sprague Dawley(SD)大鼠为受试对象,将家蝇三龄幼虫血淋巴干粉与壳聚糖按10:1的比例进行组合,采用急性毒性试验、骨髓微核试验、精子畸形试验、致畸试验和慢性毒性试验进行家蝇蛆粉的临床前安全性评价;采用休止角测定试验、水分含量测定、微生物限度检查、胶囊剂装量差异测定和崩解试验,进行家蝇蛆粉胶囊的初步质量研究。研究目的:研究家蝇蛆粉对啮齿类动物的毒性作用,并初步评价家蝇蛆粉胶囊的质量,对家蝇蛆粉进行临床前安全性评价,预测临床试验中可能出现的毒性效应或不良反应,为家蝇蛆粉的临床试验提供实验依据。研究方法:1.家蝇蛆粉的制备。用奶粉、麦麸、酵母粉混合物饲养家蝇幼虫至三龄,经冷冻诱导后收集幼虫,超声破碎,血淋巴内容物溶液经真空干燥制成蝇蛆蛋白干粉,幼虫壳滤渣制成壳聚糖,两者按10:1比例进行组合混匀,制成黄色粉末状家蝇蛆粉。2.家蝇蛆粉的急性毒性试验。家蝇蛆粉溶于0.5%稀醋酸溶液中,配成0.275g/ml的家蝇蛆粉饱和溶液。实验动物被分为2组进行灌胃:家蝇蛆粉饱和溶液最大耐受量组;0.5%醋酸溶液溶剂对照组。观察小鼠活动、外观、体重增长情况和死亡率。最后处死小鼠并进行解剖,观察器官大体情况并对肝脾进行称重,作组织病理学检查。3.家蝇蛆粉的小鼠骨髓微核试验。家蝇蛆粉溶于0.5%稀醋酸溶液中。对以下五组小鼠进行灌胃:家蝇蛆粉高剂量实验组、家蝇蛆粉中剂量实验组、家蝇蛆粉低剂量实验组、溶剂对照组和环磷酰胺阳性对照组。最后脱颈椎处死小鼠,取胸骨骨髓涂片,甲醇固定和Giemsa染色,镜检并计数其中的嗜多染红细胞微核率。4.家蝇蛆粉的小鼠精子畸形试验。用家蝇蛆粉的0.5%稀醋酸溶液对雄性小鼠同上分组灌胃。最后脱颈椎处死小鼠。每只小鼠取双侧附睾含精子的滤液涂片,甲醇固定,1%伊红染色,干燥后镜检计数精子畸形率。5.家蝇蛆粉的致畸试验。家蝇蛆粉按比例定量添加到普通饲料原料中混匀,干燥,做成高、中、低剂量家蝇蛆粉饲料。将性成熟的SD大鼠按雌雄2:1的比例同笼交配。将孕鼠分为四组:家蝇蛆粉饲料低剂量组;家蝇蛆粉饲料中剂量组;家蝇蛆粉饲料高剂量组;普通饲料对照组。于受孕后称量体重增长情况。最后脱颈椎处死孕鼠,称子宫重量,检查并记录吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎数。观察并记录每一胎鼠外观、性别、体重和体长。制作并检查胎鼠骨标本,检查胎鼠内脏,拍照。6.家蝇蛆粉的慢性毒性试验。同上制备家蝇蛆粉饲料。SD大鼠平均分为以下4组:家蝇蛆粉饲料低剂量组;家蝇蛆粉饲料中剂量组;家蝇蛆粉饲料高剂量组;普通饲料对照组。记录大鼠一般情况,体重增长情况和食物消耗量增长情况,检测白细胞等血细胞各项指标,谷丙转氨酶等血液生化指标变化情况。用药末期检测尿液生化,凝血酶原等凝血指标,2/3大鼠肝脏等器官重量与体重的比率,肝脏等器官组织病理学检查。并留下1/3大鼠检测停药恢复期以上各检测指标,以β-actin基因表达为参照,检测各组大鼠用药末期肝脏标本的毒性基因过氧化物岐化酶基因的表达量。7.家蝇蛆粉的初步质量研究。用固定漏斗法测定家蝇蛆粉的休止角,以评价其流动性;用烘干称重法测定家蝇蛆粉的含水量;用微生物限度检查法评价家蝇蛆粉的质量安全性;用崩解试验评价家蝇蛆粉胶囊的质量;用家蝇蛆粉胶囊剂的装量差异检测评价其均匀性。结果:1.急性毒性试验中,家蝇蛆粉醋酸溶液的口服最大耐受量为每天33.0g/kg体重(bw)。未见毒性症状、体征和死亡;小鼠体重增长无显著异常,小鼠大体解剖未发现异常,肝脾重量无显著改变,肝脾组织病理学检查未显示器质性病变。2.在3个剂量的家蝇蛆粉醋酸溶液的实验组和溶剂对照组之间,嗜多染红细胞微核率没有显著性差异,表明家蝇蛆粉醋酸溶液对小鼠骨髓红系细胞没有显著致突变性。3.家蝇蛆粉醋酸溶液低、中、高剂量组与溶剂对照组相比,小鼠精子畸形率无显著增高,表明家蝇蛆粉对雄性小鼠的生殖细胞无显著遗传性损害。4.致畸试验中,家蝇蛆粉饲料高、中、低剂量组与对照组相比,雌鼠体重增长未见显著差异,子宫重量未见显著差异,无吸收胎、早死胎、晚死胎;各组间雄性与雌性胎鼠数均未见显著差异;各组间雄性与雌性胎鼠的外观、体重、体长均未见显著差异。各组间胎鼠骨骼和胎鼠内脏均未见显著差异。5.慢性毒性试验中,家蝇蛆粉饲料高、中、低剂量组与对照组相比,大鼠一般情况、体重增长和食物消耗量增长未见显著差异。白细胞等血细胞各项指标,谷丙转氨酶等血液生化指标,尿液生化,凝血酶原等凝血指标均未超出SD大鼠参考范围;器官重量与组织病理学检查未见不可逆性改变;高剂量组雄性大鼠肝脏毒性基因过氧化物岐化酶基因的表达量与对照组相比未见显著差异;高剂量组雌性大鼠过氧化物岐化酶基因的表达量轻度上调。6.家蝇蛆粉休止角小于45度,流动性良好;家蝇蛆粉含水量小于9%;家蝇蛆粉未见细菌生长;家蝇蛆粉胶囊崩解时间未超过30min,符合胶囊质量标准;家蝇蛆粉胶囊装量差异小于10%,较为均匀。结论:家蝇蛆粉未见器质性急性毒性、致突变性、致畸性或非可逆性慢性毒性;家蝇蛆粉胶囊稳定、无致病微生物,适于制成抗高血脂与动脉粥样硬化药物胶囊。