自然交配和人工授精是圈养大熊猫人工繁育的主要方法。然而,在大熊猫人工授精实际操作中新鲜精液为首选,冷冻精液极少采用。大熊猫冷冻精液人工授精的产仔率低下,导致冷冻精液利用效率极差,原因在于冷冻对大熊猫精子的损伤及作用机制尚不明确。精子冷冻保存在大熊猫种质资源保护和人工繁育中具有重要的作用。目前,有关冷冻对大熊猫精子的冷冻损伤及作用机制尚未有报道。已有研究表明,精子中有大量的RNA分子,证实了miRNA调控着精子发生及成熟过程,并且影响着早期胚胎的发育和后代的性状。因此,本研究采用miRNA高通量测序技术,系统分析大熊猫新鲜和冷冻精液中miRNAs的表达差异,为进一步揭示冷冻过程中大熊猫精子miRNAs表达的变化及其靶基因作用的信号途径,探讨miRNA调控大熊猫精子冷冻保存效果的作用机制。主要结果如下:（1）大熊猫新鲜精液小RNA文库获得了16,980,071条原始序列,冷冻精液获得了19,571,331条原始序列。其中,clean reads在新鲜精液所占的比例为80.32%,冷冻精液占73.94%。（2）在新鲜精子和冷冻精子中总共检测到899个miRNAs表达。总共检测到有284个miRNA在新鲜精子和冷冻精子中表达差异显著,其中有195个miRNA表达上调,89个miRNA表达下调。（3）差异表达miRNA靶基因KEGG的注释结果表明,富集到嗅觉传导通路（Olfactory transduction）的基因数量最多,有328个。其次是神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、内质网蛋白质加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）和轴突导向（Axon guidance）,各有87、69、69个基因富集。（4）与精子凋亡相关的p53、PI3K-Akt信号通路中,PI3K-Akt通路中有15个mRNA,其中7个是新基因。其中,在新鲜精子和冷冻精子中表达差异显著的有ANGPT4、SGK2、Panda_newGene₁97067、Panda_newGene₅45068。而P53通路中表达差异显著的只有SESN2。