猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis, AR)是一种猪的主要呼吸道传染病,主要由D型产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm)和支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)单独或共同感染引起,可造成猪的慢性鼻炎、鼻甲骨萎缩甚至消失,降低猪只生产性能,严重者甚至死亡,给养殖业造成了严重的经济损失。Bb的丝状血凝素FHA和百日咳杆菌粘附素PRN被认为是该菌重要的粘附因子和抗原成分；而T+Pm toxA基因编码的皮肤坏死毒素(DNT)是其主要致病毒力因子,研究表明ToxA基因C端和N端编码的氨基酸结构分别是DNT的催化位点和粘附位点,两者都具有良好的免疫原性。本实验室分别以减毒沙门氏菌和减毒波氏杆菌为载体,已构建了表达支气管败血波氏杆菌FHA和PRN融合基因的重组沙门氏菌C501(PYA-F1P2).表达多杀性巴氏杆菌toxA基因的重组沙门氏菌C501(PYA-toxA)、分别表达多杀性巴氏杆菌toxA基因C端和N端的重组支气管败血波氏杆菌QH0814AaroA/toxAC和QH0814△aroA/toxAN。本研究将上述4种猪萎缩性鼻炎基因重组菌株作为候选疫苗,通过免疫断奶仔猪,比较不同基因重组菌株及不同免疫途径所产生的免疫应答,综合评价基因工程疫苗的免疫效果,期望筛选出一种安全、有效的基因重组疫苗,为猪萎缩性鼻炎的防控及净化提供方案和数据支撑。主要研究内容如下：1.4种基因重组疫苗菌株冻干工艺的优化分别以终浓度为10%、12.5%或15%的脱脂牛奶和5%的蔗糖的三种溶液作为基因重组疫苗的冻干保护剂,并在-40℃下预冻3h-5h后对疫苗进行冻干,利用平板计数法对冻干前后的活菌量进行计数,比较同一批次的菌株在不同浓度脱脂牛奶的冻干保护剂条件下的存活率,和同一批次菌株在同一浓度冻干保护剂下的不同预冻时间的存活率,结果表明终浓度为12.5%脱脂牛奶、5%蔗糖的溶液作为冻干保护剂,疫苗菌株的存活率最高,达到84.3%以上,最高活菌量达到5.22×1010CFU/ml。2.基因重组疫苗的安全性将4种基因重组菌株分为C501(PYA-F1P2)和C501(PYA-toxA)联合组,QH0814AaroA/toxAC组和QH0814△aroA/toxAN组3组候选疫苗,以合适免疫剂量接种28日龄仔猪,接种后7d内测量受试猪的体温,观察食欲、精神状况等,计算仔猪接种后30d的平均日增重,结果显示：受试猪健康状况良好,无明显不良反应,30d的平均日增重与对照组相比差异不明显,因此候选疫苗对仔猪具有良好的安全性；候选疫苗分别按滴鼻和肌肉注射的免疫方式接种仔猪,每天采集猪鼻腔拭子和圈舍内的水样、粪便,并将样本处理后进行PCR扩增,鉴定重组菌株的目的基因,结果显示：滴鼻免疫组的鼻拭子在接种第7天便检测不到基因重组菌株,而肌肉注射组的鼻拭子以及各组所在环境中的水样和粪便中始终未检到基因重组菌株,说明这4种疫苗菌株接种仔猪后只能在鼻腔中短期定殖,并且不会向周围环境中释放。3.基因重组疫苗最佳免疫剂量及其免疫方式的确定分别将3组候选疫苗稀释成不同梯度的免疫剂量,各组均以滴鼻和肌肉注射两种免疫方式免疫28日龄仔猪,分别在免疫后第7d、14d、21d和28d采集鼻拭子及血样,用ELISA方法检测T+Pm和Bb抗体水平,在免疫后7d内测量仔猪体温,观察仔猪的精神和采食情况,结果表明,疫苗免疫后均无不良反应,C501(PYA-F1P2)和C501(PYA-toxA)联合组的最佳免疫剂量为肌肉注射免疫5×109CFU/头；QH0814△aroA/toxAC和QH0814AaroA/toxAN滴鼻免疫的最佳免疫剂量均为6×109CFU/头,而肌肉注射免疫的最佳免疫剂量均为3×109CFU/头。4.基因重组疫苗对仔猪的免疫效力试验将4种重组疫苗以最佳免疫剂量接种28日龄仔猪,首免2周后加强免疫一次,分别在首免前、首免后14d、28d采集鼻拭子及血样,检测鼻腔粘液及血清中T+pm和Bb的IgA、IgG抗体水平。结果显示：基因重组疫苗能诱使仔猪产生针对T+Pm和Bb较高的抗体水平,而对照组的抗体水平则无升高。5.不同基因重组疫苗间以及与同类疫苗的对比试验将4种重组疫苗按照最佳免疫剂量接种28日龄仔猪,同时以进口商品化疫苗和自制二价细菌灭活苗为对照,免疫后测量各试验组仔猪体温、体重,观察并记录采食量等生产指标,计算仔猪免疫后平均日增重、料肉比,结果显示：除二价细菌灭活苗组的仔猪免疫后24h内有体温略微升高,采食量下降外,其他接种猪健康状况一直保持良好,候选疫苗组仔猪的鼻腔及血清中T+pm和Bb抗体水平均略低于进口疫苗组和二价全菌灭活苗组。仔猪的平均日增重差异不显著。与非免疫对照组相比,料肉比及药物使用量均有所降低。QH0814AaroA/toxAN与QH0814△aroA/toxAN联合免疫组和单独免疫组之间无明显的差异,但略高于C501(PYA-F1P2)和C501(PYA-toxA)联合免疫组,由此表明基因工程疫苗的免疫效果与其它疫苗组无较大差异,且具有一定的临床效果。