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G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor,GPER）属于七次跨膜G蛋白偶联受体家族,在海马、纹状体、下丘脑和黑质等多个脑区均有表达,其介导的雌激素神经保护作用已得到许多研究的证实。淫羊藿苷（Icariin）是中草药淫羊藿的主要活性成份,在淫羊藿总黄酮中含量最高。淫羊藿素（Icaritin）是淫羊藿苷主要的代谢产物,属于植物雌激素中的黄酮醇类。本课题组前期研究证明淫羊藿苷和淫羊藿素可以抑制大鼠中脑小胶质细胞和星形胶质细胞的炎症反应。但淫羊藿苷和淫羊藿素抗炎症作用的靶点尚未明确。目的:1.应用GPER 3D模型,明确淫羊藿素和淫羊藿苷是否能与GPER直接结合;2.应用GPER+/+（野生型）和GPER-/-（基因敲除）C57BL/6J小鼠,探讨GPER在淫羊藿素和淫羊藿苷抑制帕金森病（Parkinson’s disease,PD）小鼠炎症反应中的作用。方法:1.应用GPCR-I-TASSER等在线服务器进行GPER建模,应用autodock vina1.1.2等软件进行GPER与淫羊藿苷和淫羊藿素的分子对接分析,并对淫羊藿素/GPER复合体进行分子动力学分析。2.在GPER+/+和GPER-/-C57BL/6J小鼠黑质区立体定位注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）建立PD炎症模型,灌胃给予淫羊藿素（10 mg/kg）和淫羊藿苷（10 mg/kg）。3.爬杆实验,转棒实验检测小鼠的运动协调能力。4.免疫组化技术检测TH阳性神经元。5.Real time PCR技术检测诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）、环氧化酶（cyclooxygenase-2,COX-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的m RNA水平。6.Western blot技术检测i NOS、COX-2、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、小胶质细胞离子钙接头蛋白分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的蛋白表达。结果:1.分子对接表明GPER特异性激动剂G1的结合能为-9.8 kcal/mol;淫羊藿素结合于GPER N端的疏水核心,结合能为-9.3 kcal/mol,与G1的结合能相近。淫羊藿苷与GPER结合能为-6.3 kcal/mol,与淫羊藿素和GPER的结合能相比较弱。2.分子动力学模拟结果显示,淫羊藿素/GPER复合体结合自由能为-30 kcal/mol,进一步提示淫羊藿素与GPER能够较好的结合。3.行为学结果显示,LPS在GPER+/+和GPER-/-小鼠均能导致转棒和爬杆行为障碍（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿素能够改善LPS诱导的小鼠运动失调（P<0.05,P<0.001）;但在GPER-/-小鼠,淫羊藿素的改善作用明显减弱,提示GPER基因敲除干扰了淫羊藿素的神经保护作用。在GPER+/+小鼠,淫羊藿苷能够改善LPS诱导的小鼠爬杆行为障碍（P<0.05,P<0.01）,但对转棒行为没有改善;在GPER-/-小鼠,淫羊藿苷对LPS诱导的小鼠爬杆行为转头时长（T-Turn）没有影响,但改善了LPS对小鼠下杆时间（T-Total）的影响（P<0.01）。4.Western blot结果显示,LPS在GPER+/+和GPER-/-小鼠均能使黑质区TH蛋白表达降低（P<0.01,P<0.01）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿素能够显著抑制LPS引起的黑质区TH蛋白表达降低（P<0.01）;在GPER-/-小鼠,淫羊藿素的神经保护作用消失。淫羊藿苷在GPER+/+和GPER-/-小鼠均不能抑制LPS引起的黑质区TH蛋白表达降低。5.免疫组化结果显示,LPS在GPER+/+和GPER-/-小鼠均能使黑质区TH阳性神经元数目下降（P<0.01）,淫羊藿素在GPER+/+小鼠中能抑制LPS引起的黑质区TH阳性神经元数目的下降（P<0.01）,在GPER-/-小鼠中淫羊藿素不能发挥神经保护作用。淫羊藿苷在GPER+/+和GPER-/-小鼠不能抑制LPS造成的TH阳性神经元的数目减少。6.Real time PCR结果显示,LPS在GPER+/+和GPER-/-小鼠均能诱导黑质区促炎因子TNF-α、IL-1β、COX-2和i NOS的m RNA上调（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿素能够抑制LPS导致的促炎因子m RNA水平的升高（P<0.01,P<0.001）,GPER基因敲除后淫羊藿素的抗炎作用明显减弱（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿苷能抑制LPS引起的促炎因子TNF-α和i NOS m RNA水平的升高（P<0.01）,而与LPS组相比,IL-1β和COX-2 m RNA水平有下降的趋势,但无统计学意义;在GPER-/-小鼠,淫羊藿苷显著抑制IL-1β、i NOS和COX-2基因水平的升高（P<0.05）,提示在基因水平GPER基因敲除对淫羊藿苷的抗炎作用没有显著影响。7.Western blot结果显示,LPS在GPER+/+和GPER-/-小鼠均能诱导黑质区i NOS和COX-2蛋白水平的升高（P<0.01）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿素显著抑制了LPS诱导的炎症反应（P<0.05）;而在GPER-/-小鼠,淫羊藿素的抗炎作用明显减弱（P<0.05）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿苷对LPS诱导的COX-2和i NOS蛋白表达的增加有抑制趋势,但无统计学意义;在GPER-/-小鼠,淫羊藿苷不能抑制LPS诱导的i NOS、COX-2蛋白表达的升高。8.Western blot结果显示,LPS能够诱导GPER+/+和GPER-/-小鼠黑质区Iba1和GFAP蛋白表达升高（P<0.001,P<0.01）。在GPER+/+小鼠,淫羊藿素能够抑制LPS诱导的Iba1和GFAP蛋白水平的升高（P<0.001,P<0.05）,而在GPER-/-小鼠,淫羊藿素对炎症的抑制作用明显减弱（P<0.01）。淫羊藿苷在GPER+/+小鼠能够抑制LPS诱导的Iba1蛋白水平的升高（P<0.001）,对GFAP蛋白水平升高有抑制的趋势但无统计学意义;在GPER-/-小鼠,淫羊藿苷不能抑制LPS引起的Iba1和GFAP蛋白水平的升高。结论:1.淫羊藿素与GPER结合能为-9.3 kcal/mol,有很好的结合能力。淫羊藿苷与GPER结合能为-6.3 kcal/mol,与GPER的结合能力弱于淫羊藿素。2.淫羊藿素能够抑制GPER+/+小鼠黑质区LPS引起的炎症反应,而在GPER-/-小鼠中此抑制作用消失,表明GPER介导了淫羊藿素抗PD的炎症反应,且GPER可能是淫羊藿素发挥抗炎作用的直接受体。3.淫羊藿苷对LPS诱导的小鼠黑质区炎症反应有一定的抑制作用,但GPER基因敲除不能完全阻断淫羊藿苷的抗炎作用,结合分子对接的结果,我们推测可能有其它的信号途径参与了淫羊藿苷的抗炎作用。