目的:中药汤剂是中药最常见的剂型,通常以水为溶剂经煎煮而成,其中不仅存在着大量溶于水的成分,实际上更是一个复杂的胶体分散体系,其中含有大量的纳米粒子。而今纳米药物完美地解决了药物递送中的难溶、不稳定以及靶向等问题,那么是否中药汤剂中的纳米粒子具有载药性和生物活性?为了探明这些问题,首先需要明确中药纳米粒子的物理和化学性质,以此判定纳米粒子载药的可行性;其次建立适宜的、敏感的动物损伤模型,评价中药纳米粒子的生物活性。本研究选取传统经典补血方剂四物汤为研究对象。四物汤由熟地、当归、白芍、川芎四味中药组成,具有补血调血之功效,可用于治疗营血虚滞诸症。临床上主要用于治疗贫血、痛经、心绞痛、糖尿病等多种病症。现代药理学研究表明四物汤对血液系统具有多方面的生物活性,为四物汤纳米粒子生物活性验证提供了阳性参照。首先,建立四物汤中的纳米粒子提取分离方法。从纳米分散体系和药物聚集的角度对四物汤纳米粒子进行研究,探究纳米粒子的物理特征和化学组成。对四物汤纳米粒子的尺寸大小、形貌特征以及稳定性进行表征,同时对四物汤纳米粒子中的主要大分子物质如蛋白质、多糖和DNA进行含量测定。为降低药物制备难度,保证足够的给药量,选择斑马鱼(Danio Rerio)作为模式动物,利用电离辐射造成成年斑马鱼的辐射损伤模型,评价四物汤及其纳米粒子对成年斑马鱼血液系统的影响。利用苯肼造成斑马鱼胚胎溶血性贫血模型,评价四物汤及其纳米粒子对斑马鱼胚胎血液系统的影响,以期明确四物汤及其纳米粒子的药理活性。方法:1.四物汤纳米粒子的提取分离和物理、化学性质表征:采用差速离心法对四物汤纳米粒子进行分离,利用透射电镜和动态光散射技术对四物汤纳米粒子的尺寸大小、形貌特征以及稳定性进行表征。采用考马斯亮蓝法测定四物汤及其纳米粒子蛋白质含量;硫酸苯酚法测定多糖含量;试剂盒提取DNA,利用紫外分光光度法测定DNA的含量。2.斑马鱼辐射损伤模型的建立:成年斑马鱼(3-5月龄,体重0.14-0.20 g,雄性),采用60Co-γ射线作为辐射源,照射剂量为20 Gy,剂量率97.33 cGy/min,分别在辐射后3d、7d、14d剖杀动物,取肾髓细胞和外周血,利用流式细胞技术分析斑马鱼肾髓细胞和外周血细胞的数量,并分析肾髓中髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞、红细胞的数量和百分比的变化。3.斑马鱼成鱼给药剂量的探索:成年斑马鱼条件同上,给予正常斑马鱼和辐射后的斑马鱼不同浓度的四物汤,观察其存活率,确定药物最小致死剂量。给予斑马鱼不同浓度的四物汤5 d,剖杀动物,取肾髓细胞和外周血细胞,利用流式细胞技术分析斑马鱼肾髓细胞和外周血细胞的数量,分析肾髓中髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞、红细胞的数量和百分比的变化。藉此确定四物汤安全给药浓度范围。4.四物汤及其纳米粒子对斑马鱼辐射损伤模型的保护作用:参考上述斑马鱼造模条件和四物汤安全浓度范围,连续7 d给予成年斑马鱼适宜浓度的四物汤和四物汤纳米粒子,剖杀动物,取肾髓细胞和外周血细胞。利用流式细胞技术分析斑马鱼肾髓细胞和外周血细胞的数量,分析肾髓中髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞、红细胞的数量和百分比的变化,进行结果评价。5.苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型的建立:以0.005-0.1 μg/mL范围不同浓度的苯肼处理52 hpf斑马鱼胚胎24h,进行ODA染色,确定适合的苯肼造模浓度。6.斑马鱼胚胎给药剂量的探索:以不同浓度的四物汤处理斑马鱼胚胎,进行ODA染色,确定适合的给药浓度。7.四物汤及其纳米粒子对苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型的影响:参考上述斑马鱼造模条件和四物汤安全剂量范围,给予适宜浓度的四物汤和四物汤纳米粒子,进行联大茴香胺(o-Dianisidinedihydrochloride,ODA)染色。利用显微镜拍照和录制视频,观察总体血流量、心率、心包水肿面积、gata1a+细胞的数量指标以及相关基因表达情况进行结果评价。8.转录组学分析:四物汤及其纳米粒子给予苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型并进行,差异表达基因分析、GO富集分析、KEGG富集分析。结果:1.四物汤纳米粒子的提取分离和物理表征结果显示,四物汤纳米粒子NP20000 和 NP100000 的提取率分别为 0.05%和 0.03%,NP20000 和NP100000在TEM下呈现为形状圆形或不规则的纳米颗粒,纳米粒子的粒径大约在50-500 nm之间,利用DSL测得其平均粒径分别为423.0 nm和298.3 nm,PdI 分别为 0.23 和 0.30,均为中度分散。NP20000 和 NP100000的Zeta电位分别为-35.8 mV和-30.3mV,表明样品较为稳定。且在1-8 d NP20000的粒径变化不大。四物汤纳米粒子NP20000和NP100000的蛋白质含量分别为11.20%和13.53%,多糖含量分别为36.10%和56.70%,DNA含量分别为1.19‰和1.07‰。2.斑马鱼辐射损伤模型建立结果显示,辐射后第7 d,斑马鱼的造血器官肾髓总细胞、髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞、和红细胞分别下降52%、46%、49%、79%和33%,与对照组比较具有显著性差异;与7 d相比,第14 d髓系单核细胞和淋巴细胞显著升高70%以上,前体细胞和红细胞也呈小幅上升趋势;在第30d,所有细胞均超过辐射前的数量,前体细胞和髓系单核细胞升高可达辐射前的178%和112%,淋巴细胞和红细胞分别比辐射前升高51%和16%。在辐射后7-30 d各群细胞在肾髓细胞中占比变化比较复杂,红细胞和髓系单核细胞占比呈现明显的先升高再下降外的过程,淋巴细胞呈现明显的先下降再升高过程,前体细胞在14 d前占比变化不大,仅在30d显著升高。外周血细胞(主要为红细胞)的数量辐射后第7d比对照组下降26%,随即在第14 d升高至正常水平,且在第30 d超过辐射前的数量。3.斑马鱼成鱼给药剂量的实验结果显示,四物汤稀释浓度在SW100、SW200、SW600可致成年斑马鱼死亡,SW600为最小致死剂量。SW1000-SW20000这一浓度区间,未对斑马鱼的生存造成影响,且未对肾髓的各种细胞以及外周血细胞造成明显的毒性,为适宜的给药浓度。4.四物汤及其纳米粒子对斑马鱼辐射损伤的保护作用结果显示,模型组肾髓细胞及其中四种细胞数量显著下降,与之相比,四物汤SW5000处理组肾髓细胞总数、髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞和红细胞分别增加了 57%(p=0.001)、125%(p=7.35×10-8)、81%(p=0.001)、59%(p=0.03)和 35%(p=0.019);NP2000处理组肾髓细胞总数、髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞和红细胞分别增加了 16%、46%、11%、11%和7%,髓系单核细胞具有显著性差异(p=0.011)。5.苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型建立结果显示,苯肼浓度范围在0.02 μg/mL-2.5 μg/mL均可以造成ODA染色面积的减少,代表红细胞数量减少,经比较,0.02 μg/mL作为最佳造模浓度。6.斑马鱼胚胎给药剂量的确定结果显示,SW100浓度可导致斑马鱼胚胎死亡,SW500-SW10000浓度范围处理斑马鱼胚胎未见胚胎死亡、畸形或其他异常。SW500-SW10000为四物汤对斑马鱼胚胎的安全浓度范围。7.四物汤及其纳米粒子对苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型的影响。结果显示,SW1000和NP250处理明显增加苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型的血流量,SW500、SW1000和NP250处理可明显增加gata1a+的细胞数量和流过尾部血管的gata1a+细胞的数量。NP250、NP1000和NP5000处理明显降低斑马鱼胚胎心包水肿的面积。四物汤及其纳米粒子对苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型alas2、epo、pu.1、mpeg1、rag2基因表达的影响,与模型组相较,SW500组和NP250组alas2表达均显著上调(p<0.001);与模型组相较,SW500组和NP250组epo表达显著下调(p<0.01);与模型组相较,NP250组pu.1表达显著下调(p<0.01);与模型组相较SW500组和NP500组rag2表达均显著下调(p<0.001)。SW500组和NP500组mpeg1表达与模型组相较无显著差异(p>0.05)。8.SW500组与Model组相比,差异表达基因共有49个,其中有23个基因表达上调和26个基因表达下调。而NP250组与Model组相比,差异表达基因有30个,其中有15个基因上调15个基因下调。通过GO富集分析SW500与Model组和NP250组与Model组的差异表达基因富集到四条相同的途径碳水化合物的代谢过程(carbohydrate metabolic progress)、血红素结合(heme binding)、四吡咯结合(tetrapyrrolebinding)、辅因子结合。通过KEGG富集分析SW500组与Model组中差异表达基因富集到5条通路差异显著(p<0.05),分别为剪接体(Spliceosome)、内质网蛋白质加工(Proteinprocessing in endoplasmic reticulum)、MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、核糖体(Ribosome)、内吞作用(Endocytosis)。NP250组与Model组中差异表达基因富集到有3条通路差异显著(p<0.05),分别为剪接体(Spliceosome)、内质网蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、内吞作用(Endocytosis)。结论:1.差速离心法可获得粒径分布于100-1000nm的四物汤纳米粒子,物理性质表明四物汤纳米粒子可形成较为稳定的胶体分散体系。该粒子中含有大量蛋白质、多糖以及极少量的DNA,这些大分子作为载体为纳米粒子形成提供了可能性。2.60Co电离辐射以20 Gy剂量,97.33 cGy/min剂量率照射可以造成成年斑马鱼血液系统可逆性损伤,该损伤可以在30 d内自行修复。3.四物汤SW5000和四物汤纳米粒子NP2000对辐射导致的斑马鱼肾髓造血功能损伤具有再生促进作用,同时四物汤纳米粒子对外周血细胞具有辐射保护作用。4.给予斑马鱼胚胎0.02 μg/mL苯肼可以造成适度的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型。5.四物汤及其纳米粒子对苯肼诱导的斑马鱼胚胎溶血性贫血模型中血细胞具有保护作用,同时可减轻苯肼的心脏毒性。6.对Control组、Model组、SW500组和NP250组进行转录组测序分析后发现,GO富集分析结果显示四物汤及其纳米粒子参与的生物过程均与血红素合成、降解以及蛋白结合密切相关。KEGG信号通路富集分析表明四物汤及其纳米粒子主要参与的信号通路有剪切体、内质网蛋白质加工、内吞作用等。总而言之,本实验表明斑马鱼可以用于中药的血液系统药效研究,四物汤水溶性成分和溶液中的粒子性部分共同贡献于四物汤的血液系统保护作用。