【摘 要】
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目的:探讨spastin能否进行SUMO（Small ubiquitin-like modifiers）化修饰及SUMO化修饰如何调控微管动态性从而影响神经元生长发育。方法:首先,用pull down、Co-IP、免疫细胞荧光染色及BIFC的方法检测spastin在体内外是否与SUMO结合。通过软件预测spastin潜在的SUMO化位点,并通过免疫荧光化学和分子实验鉴定spastin的SUMO化修
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目的:探讨spastin能否进行SUMO（Small ubiquitin-like modifiers）化修饰及SUMO化修饰如何调控微管动态性从而影响神经元生长发育。方法:首先,用pull down、Co-IP、免疫细胞荧光染色及BIFC的方法检测spastin在体内外是否与SUMO结合。通过软件预测spastin潜在的SUMO化位点,并通过免疫荧光化学和分子实验鉴定spastin的SUMO化修饰位点。然后,根据突变位点构建的突变体质粒转染神经元,细胞免疫荧光化学观察神经元突起生长的变化。将spastin与SUMO1或SENP1共转COS1细胞,确定不同spastin SUMO化修饰状态对微管切割的影响。用免疫荧光染色的方法分析spastin K427R如何影响微管的动态性;接下来过表达spastin K427R观察spastin K427R促进或抑制微管的修饰,并确定其对海马神经元生长的影响;最后,通过免疫细胞化学染色观察spastin对不同修饰状态下微管切割活性的影响,确定spastin对不同修饰状态的海马神经元突起生长的影响。结果:（1）Pull down及Co-IP实验显示,SUMO蛋白可以成功的层析出spastin蛋白;免疫化学染色实验显示spastin与SUMO存在共定位;BIFC实验显示,转染SUMO1-N YFP+spastin-C YFP转染组观察到了清晰的黄绿色荧光,荧光分布呈现微管的形状;（2）预测spastin存在3个潜在的SUMO化位点,发现spastin K427 AAA失去了切割微管的活性;进一步发现spastin K427A和spastin K427R失去了切割微管的活性;Co-IP实验结果表明Spastin K42R不与SUMO1结合;（3）Spastin K305AAA和K530AAA可以促进突起分支;而突变K427之后的K427AAA和panAAA都不能促进突起发育,甚至出现了抑制突起生长的情况;（4）Spastin与SUMO共转COS1细胞,细胞微管荧光强度较对照组明显减弱。Spastin与SENP1共转COS1细胞,细胞微管荧光强度较对照组增强;（5）GST pull down显示spastin K427R蛋白可以成功的层析出tubulin微管蛋白;免疫化学染色显示spastin K427R与不同修饰状态下的tubulin存在共定位;（6）Spastin K427R具有抵抗nocodazole解聚微管的作用;另外,spastin K427R具有抵抗被nocodazole解聚微管的重新再聚合的作用;（7）过表达spastin K427R的COS1细胞,免疫荧光显示ACE和glu微管的荧光强度明显较对照组强,而TYR修饰微管的荧光强度没有明显区别;过表达spastin K427R的HEK293细胞,Western blot显示spastin K427R乙酰化及去酪氨酸化微管表达明显增加,Tyr修饰状态的tubulin及总的tubulin则无明显变化;（8）在COS1细胞中过表达spastin与TTLL4或TTLL6,微管的荧光强度较对照组明显更低。HDAC6与spastin共转染的COS1细胞中,细胞的微管荧光强度明显低于对照组,且微管切割的形态与单转spastin切割的微管形态基本相同。最后,我们发现spastin K427R与spastin共转染的COS1细胞中,细胞的微管荧光强度明显高于对照组,微管位切割成长短不等的片段;（9）在神经元中共同过表达spastin与TTLL4或TTLL6或HDAC6,神经元突起分支数较对照组明显增多,用tubacin处理的的神经元分支数明显减少。与spastin K427R与spastin共同过表达的神经元,突起分支数明显受到抑制。结论:（1）Spastin可进行SUMO化修饰,且修饰位点位于第427个精基酸;spastin SUMO化修饰后发挥作用的靶标是微管;（2）SUMO化修饰促进spastin对微管的切割活性,反之,去SUMO化修饰的spastin抑制微管的切割活性并抑制神经元突起的生长;（3）Spastin K427R可与tubulin相结合,spastin K427R可促进微管ACE和GLU修饰,抑制微管动力并抑制神经元突起的形成;（4）GLU修饰的tubulin促进spastin的切割活性并促神经元分支作用。ACE修饰的tubulin抑制spastin的切割活性,形成更少的微管小片段并抑制spastin的促神经元分支作用。
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