第一部分：壳聚糖/肝素层层自主装涂层的生物相容性的实验研究目的：研究壳聚糖/肝素层层自组装涂层对CD133+内皮祖细胞的黏附、增殖相关基因表达的影响,并从分子生物学角度探讨其作为促内皮修复功能药物洗脱支架涂层材料的可行性。方法：1.分离人脐血单个核细胞,免疫磁珠分选CD133+内皮祖细胞；2.制备壳聚糖/肝素层层自组装涂层,1%明胶涂层以及玻璃对照皿,接种并培养分选所得内皮祖细胞；3.免疫荧光鉴定内皮祖细胞；4.抽提总RNA, RT-PCR法比较不同培养介质中细胞的eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1、Sirtuin-1、Thrombomodulin等基因的表达差异。结果：1.重力梯度离心及磁珠分选法所得CD133+内皮祖细胞纯度较高(92.88%±0.51%(n=4)),在VEGF诱导下能较好的分化为内皮细胞；2. eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1和Sirtuin-1在壳聚糖/肝素层层自组装涂层组表达丰度较玻璃对照组显著增高(P<0.05),与明胶组差异不明显,Thrombomodulin在壳聚糖涂层表达丰度较明胶组、玻璃组表达均增高(P<0.05)。结论：1.重力梯度离心及磁珠分选法所得CD133+内皮祖细胞纯度较高(92.88%±0.51%(n=4)),在VEGF诱导下能较好的分化为内皮细胞；2. eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1和Sirtuin-1在壳聚糖/肝素层层自组装涂层组表达丰度较玻璃对照组显著增高(P<0.05),与明胶组差异不明显,Thrombomodulin在壳聚糖涂层表达丰度较明胶组、玻璃组表达均增高(P<0.05)；3.壳聚糖涂层能促进内皮祖细胞的黏附、增殖,生物相容性好,为理想的生物材料。第二部分：壳聚糖/肝素层层自组装(LBL)支架、LBL-Drug支架的制备及相关特性研究目的：制备壳聚糖/肝素层层自组装涂层支架(LBL), LBL-Drug支架,并对其机械性能、坚韧性、亲水性、药物释放特点、细胞黏附能力等理化性能做检测。方法：1.通过浸泡法制备LBL支架,喷涂法制备雷帕霉素药物洗脱支架(Drug),非对称涂层处理方法制备LBL-Drug支架；2.电镜观察支架压握及扩张后变化,支架坚韧性实验,测定所制备支架的接触角,LBL-Drug支架的药物体外释放测试,以及体外模拟内皮细胞黏附实验,观察支架的性能。结果：1.成功制备了壳聚糖／肝素层层自组装支架(LBL)、LBL-Drug支架,对其物理性能及药物释放等特点进行检测,其表征特点符合支架制作的工艺要求,压握及扩张后涂层覆盖均匀无开裂脱落,在干性湿性条件下扩张均无明显差异,支架接触角的检测表明经过层层自组装技术处理后支架亲水性增强,具有良好的生物相容性；2. LBL-Drug洗脱支架雷帕霉素释放曲线呈爆发性释放的特点,与目前上市的雷帕霉素药物洗脱支架的释放特点一致；3.体外模拟细胞黏附试验可以得出经LBL处理的支架细胞黏附能力增强,支架涂层材料具有良好的生物相容性。结论：1.上述支架制备工艺符合植入性冠脉支架的基本要求；2.经LBL处理的支架其亲水性增强,生物相容性增加;3.经LBL处理的支架能促进细胞黏附的能力,可以促进早期内皮修复。第三部分：动物实验评价促内皮修复药物洗脱支架的有效性和安全性目的：小型猪动物模型中观察促内皮修复药物洗脱支架(LBL-Drug支架)的有效性和安全性。方法：1.将BMS及第二部分所制备的LBL、Drug、LBL-Drug支架随机植入小型猪的前降支、回旋支和右冠状动脉,通过过度扩张形成冠脉损伤模型。术后1周,1月,3月,6月时,观察支架内皮覆盖情况、内膜增生情况、植入部位炎症；2.6月时血管内超声评价内膜增生情况；3.1、3、6月随访冠脉造影时经冠脉注入乙酰胆碱,观察内皮依赖的血管收缩反应,了解内皮功能。结果：1.各组支架内皮覆盖速度具有差异,其中LBL和LBL-Drug组覆盖速度较快,在植入1周后即开始有部分内皮覆盖,其速度快于BMS组,而单纯Drug组支架的内皮覆盖率最慢,1月时四组内皮均覆盖完整,至6月时,四组内皮覆盖完好,其中LBL和LBL-Drug组较BMS组及Drug组比较,内皮相对光滑,连接紧密,BMS组出现内膜增殖导致管腔狭窄；2.通过病理切片观察及计算机辅助测量,Drug-LBL组和Drug组管腔面积在1月、3月、6月时与其他两组低,差异有统计学意义(P<0.05),而BMS组和LBL组间差异无统计学意义(P>0.05); Drug-LBL组和Drug组的新生内膜面积和新生内膜厚度在1月、3月、6月时比其他两组低,其差异有统计学意义(P<0.05),BMS组和LBL组间差异不明显(P>0.05); LBL-Drug组和Drug组狭窄率在1月、3月、6月时比其他两组低,差异有统计学意义(P<0.05),BMS组最高。3.从炎症细胞浸润上看,1月时Drug支架炎症浸润最严重,炎症积分高,各组1月时的炎症积分分别为：BMS0.71±0.69, LBL0.5±0.5, Drug 1.71±0.69, LBL-Drug 0.71±0.69。Drug炎症积分较其他三组高,其差别有统计学意义(P<0.05),BMS,LBL及LBL-Drug组间差别无统计学意义(P>0.05),3月及6月时炎症细胞浸润较1月时减轻,各支架组的炎症积分差别无统计学意义(P<0.05)；4.6月时IVUS检查见BMS组支架内明显内膜增生,管腔狭窄率60%左右,LBL组支架内仅轻度内膜增生,Drug支架组和LBL-Drug支架组,未见明显内膜增生；5.乙酰胆碱观察内皮依赖的血管收缩试验可以得出,3个月时受乙酰胆碱最明显,而6个月时则开始恢复。Drug组支架对于内皮功能的影响最大且持续时间最长,而带有LBL涂层的支架则受内皮功能的影响相对小,且在3个月时开始恢复,6个月时基本恢复到安装支架时的水平。LBL支架对内皮功能的影响较Drug支架小,且内皮功能恢复早。结论：1.所制备的四组支架在小型猪冠状动脉植入的模型是可行的,通过1-6个月的随访可以评价其安全性及有效性。2. LBL-Drug组和Drug组在1月,3月,6月时其管腔面积大于BMS组和LBL组,狭窄率低于BMS组和LBL组,新生内膜面积和新生内膜厚度低于BMS和LBL组。Drug组在植入1月后炎症反应最大。LBL-Drug支架在植入6月后内膜覆盖完整规则,无支架内狭窄,支架周围炎症反应低,结果理想。3.采用非对称涂层技术(LBL-Drug支架),支架内层单纯涂层LBL促进内皮细胞修复,支架外层采用可降解材料及抗增殖药物,在抑制平滑肌细胞增殖同时促进内皮快速覆盖,使支架在有效性和安全性见达到平衡。该新型支架的动物实验数据将有助于提供内皮修复药物洗脱支架的进一步研制的关键参数,为下一步深入研究和应用打下理论和实验基础。