桑黄类群真菌系统学及桑黄纤孔菌液体发酵研究

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“桑黄”[曾被广泛称为Phellinus linteus (Berk.&M.A. Curtis) Teng]是我国一类传统药用真菌的俗称,但一直以来,该类群真菌的分类与系统发育研究一直存在争议和不明确性。目前,称为“桑黄”的药用真菌的研究和产品开发如火如荼,但同时存在的名称混乱现象也日益严重,极大地制约了这一宝贵药用真菌资源的科学利用和健康可持续发展。为此,本研究通过对来自东亚、美洲和非洲大量标本的研究,明确了该类群种类的形态分类依据和系统发育关系以及与地理分布和寄主间的联系。另外,首次对桑黄纤孔菌Inonotus sanghuang Sheng H. Wu, T. Hatt.&Y.C. Dai进行了液体发酵以及有效活性成分和体外抗氧化活性的研究。桑黄类群(Inonotus linteus complex)包括多个形态特征类似的种:子实体盖形,菌肉菌丝一体系,菌管菌丝二体系的多样的菌丝系统。子实层具刚毛,担孢子宽椭圆形至近球形,黄色,厚壁。本论文研究中,将来自中美洲的一个裂蹄纤孔菌Inonotus linteus标本,作为该种的研究材料,完善并进一步界定了狭义上该种的形态和系统发育学信息。据此,来自中美洲的一个新种:古巴纤孔菌I. cubensis Y.C. Dai, Decock&L.W. Zhou和来自东亚地区的两个新种:高山纤孔菌I. alpinus Y.C. Dai&X.M. Tian和环区纤孔菌I. zonatus Y.C. Dai&X.M. Tian被发现。基于ITS序列进行的系统发育学分析也进一步明确了该类群中其它8个种:鲍姆纤孔菌I. baumii T. Wagner&M. Fisch.,裂蹄纤孔菌I. linteus (Berk.&M.A. Curtis) Teixeira,小孔忍冬纤孔菌lonicericola (Parmasto) Y.C. Dai,大孔忍冬纤孔菌I. lonicerinus (Bondartsev) Sheng H. Wu,Y.C. Dai&T. Hatt.,瓦宁纤孔菌I. vaninii (Ljub.) T. Wagner&M. Fisch.,桑黄纤孔菌I. sanghuang Sheng H. Wu, T. Hatt.&Y.C. Dai,锦带花纤孔菌I. weigelae T. Hatt.&Sheng H. Wu和韦尔纤孔菌I. weirianus (Bres.) T. Wagner&M. Fisch在该类群中的独立分枝地位。I. tenuicontextus L.W. Zhou&W.M. Qin经研究证实是I. weigelae的同物异名。另外,还给出了一个关于该类群11个种的形态分类检索表。对于该类群中专性寄生于桑树上的桑黄纤孔菌I. sanghuang,利用响应面分析的方法进行了液体发酵培养基的优化。首先应用N=12的Plackett-Burman设计法对影响桑黄纤孔菌菌丝生物量的发酵培养基组分进行筛选,选取的8个相关因子为:玉米粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物、麸皮、KH2PO4、MgSO47H2O和发酵液起始pH。统计分析表明,影响桑黄纤孔菌菌丝生物量的关键因子为玉米粉、酵母抽提物、麸皮和pH。在进行最陡爬坡试验逼近4个关键因素的最大响应区域的基础上,采用4因素3水平的Box-Behnken设计法对发酵培养基组分进行优化,获得的最佳培养条件为:玉米粉38.96g/L,葡萄糖25.00g/L,蛋白胨3.75g/L,酵母抽提物4.15g/L,麸皮20.55g/L, KH2PO41.25g/L, MgSO47H2O0.625g/L和pH6.39。在此条件下,桑黄纤孔菌菌丝生物量预测值和验证值分别为17.60g/L和18.33±0.86g/L,达优化前(7.29g/L)的2.5倍。利用水提醇沉法提取得到桑黄纤孔菌液体发酵胞内多糖(IPS)和胞外多糖(EPS)粗提物后,通过葡聚糖凝胶Sephadex G-100进行分级纯化,分别获得两个胞内多糖组分IPS1、IPS2和两个胞外多糖组分EPS1、EPS2。通过分析6个桑黄纤孔菌多糖样品的多糖含量和体外清除DPPH自由基活性的结果发现,供试6个多糖样品的多糖含量与体外清除DPPH自由基活性没有明显的相关性;桑黄纤孔菌胞内多糖的3个样品在6.25μg/mL至500μg/mL浓度范围内,DPPH自由基清除率随样品浓度增高而逐渐增强,具有一定的体外抗氧化活性;桑黄纤孔菌胞外多糖的3个样品在试验浓度范围内没有明显的清除DPPH自由基活性。为探讨两阶段培养模式对桑黄纤孔菌液体发酵代谢产物积累的影响,在振荡培养10d后,继续静置培养30d,并跟踪测定了桑黄纤孔菌菌丝体中总黄酮、总多酚和总多糖的含量变化以及菌丝体醇提物(IS-EtOH)和水提物(IS-H2O)体外清除DPPH自由基和羟自由基的活性变化情况。试验结果显示:菌丝体中总黄酮和总多酚的含量在经过10d和15d的静置培养后,分别提高了37.92%和77.27%;随静置培养时间的延长,菌丝体醇提物中黄酮类组分的种类不断丰富,根据初步的HPLC检测结果,推测可能含有:芦丁、柚皮素、圣草酚和樱花亭4种黄酮类成分;桑黄纤孔菌菌丝体中酚类结构的代谢产物(总黄酮和总多酚)在桑黄纤孔菌菌丝体提取物体外清除DPPH自由基和羟自由基方面,发挥了主要作用。
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