布鲁氏菌病(Brucellosis)是世界范围内发生的一种重要的人畜共患病,严重危害到流行地区畜牧业健康稳定发展,并对人的生命财产安全构成直接威胁。近年来该病在世界许多国家和地区,尤其是发展中国家,重新发生并流行。常规血清学诊断方法和常规弱毒疫苗的应用及其相应的综合防控措施,在动物布鲁氏菌病的诊断与防控史上发挥了重要作用。但是常规弱毒疫苗的残余毒力易致孕畜流产,疫苗菌株的不稳定易影响受免动物的最终免疫效果,并引起变态不良反应。常规的血清学诊断方法也不能区分自然感染与疫苗免疫引起的抗体反应。布鲁氏菌bp26基因缺失突变的新型标记疫苗,为动物布鲁氏菌病的防控与净化提供一条新途径,不仅秉承了亲本疫苗株的生物学特性和良好免疫保护性能,而且比亲本株的毒力更低,遗传稳定性更好,同时通过携带有bp26基因编码蛋白的靶标(缺失基因后的负向标记)可建立相应的鉴别诊断方法。但布鲁氏菌bp26蛋白作为诊断抗原存在假阳性现象,bp26蛋白作为诊断用抗原的抗原特异性有待提高；另外,不同宿主动物对不同毒力菌株bp26基因编码蛋白的免疫原性差异,也会影响该蛋白作为鉴别诊断用抗原的实际应用效果。试验1：布鲁氏菌bp26基因的扩增、序列测定及其生物信息学分析布鲁氏菌属各菌种间的bp26基因高度保守,该基因编码的蛋白已证明对羊、牛和人均具有良好的免疫原性,是一种有望成为该病诊断的候选抗原及作为该基因突变缺失疫苗株的分子靶标。本试验参考Rosetti et al (1996)的文章和序列(AY166766),设计一对引物,以羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90的DNA为模板,通过PCR特异扩增,获得了预期长度为990bp的产物,经核酸电泳初步鉴定后纯化。对PCR纯化产物测序结果表明PCR扩增片段上包含了布鲁氏菌bp26基因的完整阅读框(ORF)。最后利用相关软件对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果表明M5-90株bp26基因在布鲁氏菌属各代表种核苷酸组成(除犬种外,仅59.4%)、氨基酸组成均高度保守,同源性分别达到99.3%、97.6%以上；编码蛋白的理论分子量MW=26.569Da,等电点pI=6.62；在氨基酸第1-29位置间存在信号肽Ⅰ可能性大；该蛋白N端第29-39、64-69、109-120、171-176和204-209的五个区段较有可能为B细胞抗原的线性表位。试验2：布鲁氏菌bp26和Δbp26的基因克隆及其原核表达重组子的构建以布鲁氏菌M5-90的DNA为模板,PCR扩增bp26和截断bp26(Δbp26)基因,PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ-L酶切后,连接到原核表达载体pQE32,重组质粒转化到感受态细胞M15[pREP4]中,在LB-Km-Amp固体培养基上筛选阳性克隆,菌落PCR鉴定,提取质粒进行单、双酶切鉴定和测序鉴定。结果表明获得了插入子序列与连接部位正确且阅读框完整的原核表达重组子(pQE32-rbp26和pQE32-r△bp26)。试验3：几种重组布鲁氏菌bp26蛋白的抗原特性比较及M5-90-26标记疫苗鉴别诊断抗原的筛选以pET30a(+), pGEX-6P-1, pQE32为载体重组构建的四种原核表达羊种布鲁氏菌M5-90株bp26基因的重组质粒pET30-rbp26,6P-1-rbp26, pQE32-rbp26和pQE32-rAbp26,转化相应的感受态细胞后,表达、纯化获得抗原,western-blot(鼠抗rbp26抗体)和iELISA试验比较分析其抗原特性(RBPT、Svanova-cELISA两种方法验证的阴性参考羊血清90份、阳性参考羊血清30份)。结果表明,特异性分别为99%、98%、99%和100%,敏感性分别为27%、30%、27%和23%,rbp26-4具有很好的抗原特异性,并命名为rAbp26,适合作为布鲁氏菌标记疫苗M5-90-26鉴别诊断用抗原。试验4：截短表达布鲁氏菌bp26基因重组融合蛋白纯化方法的建立及其抗原特性分析本研究将重组质粒pQE32-rAbp26转化E. coli M15[pREP4],经表达后,在AKTAexplorer系统上采取IMAC和SEC二步法对重组融合蛋白(rAbp26)纯化,获得了理想的纯化抗原。Western blot试验表明,rAbp26蛋白与鼠抗rbp26高免血清(抗体)、羊和牛布鲁氏菌多克隆抗体反应呈阳性结果,而鼠抗rAbp26抗体与E.coli. O:157、Salmonella group D、C1、B和Yersinia enterocolitia O:9五种革兰氏阴性菌抗原反应呈阴性结果,表明rΔbp26蛋白具有良好的抗原活性和抗原特异性。试验5：布鲁氏菌bp26抗体iELISA检测方法的建立和最适条件确定本研究将纯化的rAbp26作为抗原包被酶标板,建立了适用于新型标记疫苗M5-90-26鉴别诊断的羊种布鲁氏菌bp26抗体iELISA检测方法(△bp26-iELISA),并对该方法进行优化,从而确定该方法的最适条件：抗原最佳包被浓度为2μg/ml；血清的最佳检测浓度为1/50稀释；血清的最佳反应条件为37℃60分钟；酶标抗体的最佳反应条件为37℃60分钟；底物的最佳反应条件为37℃15分钟。试验6：布鲁氏菌bp26抗体iELISA方法的临界点确定及其在鉴别诊断上的初步应用利用△bp26-iELISA方法对来自不同背景的经过RBPT和cELISA两种方法验证过的阴性羊血清(494份)和阳性羊血清(186份)进行抗bp26蛋白抗体的检测。获得的检测数据,首先将其中92份阴性羊血清均值(X)+3倍标准差(SD)来对其临界值(Cov)进行初步确定,然后通过Medcalc 9.6.0软件进行全部数据的ROC分析,进一步优化临界点的赋值(临界值),同时对动物攻毒血清、疫苗免疫血清及现地血清进行检测。结果表明,临界值Cov=0.7816时,Dsn值为18.6%,Dsp值为96%。结合RBPT、cELISA等敏感方法,M28攻毒试验,M5-90、M5-90-26和S2免疫试验及现地检测结果,该法能鉴别羊群布鲁氏菌标记疫苗M5-90-26免疫与自然感染或常规疫苗免疫(M5-90、S2)免疫产生的抗体。试验7：布鲁氏菌bp26抗体iELISA即用型试剂盒的研制根据临床和或现地用诊断试验的要求,在我们已有研究结果的基础上进行了即用型试剂盒的研制。配制了所需的阴阳性血清、洗涤液、包被抗原的封闭液和保护液、样品稀释液、二抗工作液、显色液等试剂,并进行了敏感性与特异性试验、重复性试验(批内与批间重复试验)和保存期试验(老化试验),结果表明组装试剂盒有效期达1年以上。试验8：布鲁氏菌bp26蛋白的免疫原性研究利用建立的△bp26-iELISA方法分别对试验组1、试验组2和试验组3进行抗bp26蛋白抗体的检测,分析它们的抗体应答水平；同时通过与RBPT、cELISA试验结果的比较,分析不同诊断用抗原的免疫原性强弱。结果表明,在试验组1中M5-90疫苗在小鼠、山羊上抗体效应水平较高,表现出很好的免疫原性、而在绵羊上次之,在牛上表现较弱；通过对小鼠抗bp26蛋白抗体及其分型抗体的检测,结果表明bp26蛋白在小鼠体内能诱导较强的体液免疫反应,且以IgG1亚类抗体为主。在试验组2的山羊免疫试验中M5-90疫苗株的抗体效应水平较高,表现较好的免疫原性,S2疫苗株次之,S19疫苗株最弱。在试验组3中发现免疫状态良好的山羊对M5-90疫苗表现出较好的免疫应答水平,而免疫状态差的山羊对M5-90疫苗表现出较差的免疫应答水平。在比较试验中,发现bp26蛋白抗原的免疫原性不如含菌体蛋白与S-LPS等多种抗原成份的菌悬液和单一S-LPS抗原的免疫原性。