转录因子CsBZIP40增强柑橘对溃疡病抗性的分子机制解析

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柑橘溃疡病是由黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起的检疫性病害,给柑橘产业的健康发展带来极大威胁,培育抗性品种是降低柑橘溃疡病危害的根本途径。因分子育种具有准确、高效等优点,近年来得到较快的发展。实验室前期证明CsBZIP40超量表达提高了柑橘对溃疡病的抗性,表明CsBZIP40是柑橘中重要的溃疡病抗性基因。理清CsBZIP40正调控柑橘对溃疡病抗性的分子机制,鉴定该转录因子调控的下游基因,解析CsBZIP40的调控网络,为进一步进行柑橘抗溃疡病分子育种提供理论依据。柑橘转基因后,可能会引起柑橘在基因转录水平、转录调节水平、蛋白质水平、产物代谢水平发生一系列的变化,这些差异可能与柑橘溃疡病抗性密切相关。本研究主要从上述几方面进行研究,主要结果如下:1.获得超表达CsBZIP40转基因柑橘。构建GFP-CsBZIP40超表达载体后转化柑橘试管实生苗上胚轴,获得带GFP标签的超量表达CsBZIP40转基因柑橘植株,对转基因植株进行溃疡病抗性评价,确定溃疡病抗性提高的转基因柑橘株系。以此为材料对CsBZIP40的调控机制进行解析。2.CsBZIP40互作蛋白鉴定。为筛选CsBZIP40的互作蛋白,首先构建GST-CsBZIP40融合诱饵蛋白表达载体,表达、纯化诱饵蛋白后与超量表达CsBZIP40转基因柑橘总蛋白进行孵育,SDS-PAGE显示,诱饵蛋白能特异的与柑橘总蛋白中一些蛋白结合,将这些蛋白质谱分析,得到6个与转基因柑橘提高溃疡病抗性密切相关的蛋白。3.CsBZIP40调控下游基因鉴定。为分析超量表达CsBZIP40后转基因柑橘的基因表达差异,对转基因柑橘植株进行转录组分析。与野生型相比有599个差异表达基因,上调表达,结合生物胁迫响应通路分析,初步确定部分基因在植物激素信号、细胞壁相关基因、PR蛋白基因、ROS清除相关基因和过氧化氢酶基因在转基因后表达差异明显,这些差异表达基因可能在柑橘提高溃疡病抗性方面发挥着重要的作用。4.CsBZIP40靶基因鉴定。该研究采用染色质免疫共沉淀技术结合二代测序技术(CHIP-seq)在柑橘全基因组范围内寻找CsBZIP40的靶位点。结果显示CsBZIP40一共有634个靶位点,其中有241个位点定位于基因的启动子区域。将染色质免疫共沉淀(CHIP-seq)数据联合转录组(RNA-seq)数据分析,筛选出4个CsBZIP40靶基因,分别是过氧化物酶基因(orange1.1t02040)、发病相关基因转录激活因子ERF(orange1.1t00851)、超氧化物歧化酶(Cs8g15520)、乙烯应答转录因子(s6g18930),进一步明晰了CsBZIP40的调控机制。5.根据CHIP-seq和RNA-seq数据结果,分析超量表达CsBZIP40转基因柑橘相关生化指标,结果显示,超表达CsBZIP40转基因柑橘叶片内水杨酸含量上升,水杨酸在激活柑橘抗病途径中起着重要作用;超表达CsBZIP40后降低了SOD、POD活性,这些抗氧化酶活性的改变可能与转基因柑橘抗病性提高相关;超表达CsBZIP40转基因柑橘叶片内ROS、H2O2、O-含量上升,这些含量的提高可以促进转基因柑橘的超敏反应,阻止转基因植株溃疡病病情发展,提高转基因柑橘的抗病性。综上所述,本论文从蛋白、转录和转录调控、生化指标方面差异分析,分析转基因柑橘超量表达CsBZIP40后应对溃疡病菌的调控分子机制,为精准挖掘抗溃疡病基因,进行柑橘抗溃疡病分子育种奠定理论基础。
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