盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度的Na+对许多高等植物的生长和发育造成很大的伤害。盐胁迫对植物的伤害主要由两方面的因素引起：一是离子胁迫，大量的Na+进入到植物体内，不但打破了体内原有的离子平衡，而且影响了细胞的代谢和细胞的K+/Na+比率，造成MDA积累及膜脂和膜蛋白损伤；二是渗透胁迫，盐分使土壤中的水势降低，从而引起植物体的水分缺乏。目前，植物中用来消除Na+毒害的策略主要包括：减少外界Na+的吸收，Na+的外排和Na+的区隔化。目前虽然已知Na+可能是通过根的一些K+通道进入到植物细胞，但是具体的分子机制仍待于进一步研究。根系细胞Na+外排主要是通过定位于细胞质膜的Na+/H+antiporter转运蛋白来完成的。Na+区隔化是植物细胞利用H+浓度梯度通过定位于液泡膜的Na+/H+antiporter转运蛋白将细胞质中的Na+转运到液泡中，一方面降低了细胞质中Na+的浓度，减少过量Na+对植物细胞的损害，另一方面可以维持植物细胞的膨压，增加植物细胞吸水和保水的能力。 随着植物分子生物学的发展，人们通过对拟南芥的研究，在植物耐盐和耐旱方面取得重大的研究成果，特别是对植物在胁迫条件下的信号转导、转录水平的调控、胁迫条件下离子的渗透平衡、细胞的抗氧化作用、渗透保护物质的合成等诸多方面都有了较为深入的了解。但是拟南芥是一种典型的非盐生植物，作为耐盐和耐旱机制研究的模式植物有一定的局限性。盐芥(ThellungiellasalsugineaorThellungiellahalophila)是拟南芥的近缘物种，是一种高度耐盐耐旱的盐生植物。该种植物在盐胁迫的前后既不产生盐腺也没有形态上的明显变化，表明其耐盐性在很大程度上取决于该物种的基本生理及其生化机制。而且盐芥具有cDNA序列与拟南芥相似程度高、基因组小等优点，近几年来逐渐成为人们研究植物非生物胁迫的模式植物。本研究以盐芥作为实验材料，分别构建了盐芥的小片段基因组文库以及盐胁迫处理的cDNA文库。分别克隆了盐芥盐胁迫诱导基因TsVP和Na+/Pi转运体基因及其启动子序列，并对这两个基因的功能及表达模式进行了研究。 盐芥TsVP基因的克隆和功能分析 利用拟南芥中氢离子焦磷酸酶基因的序列信息，从盐生植物盐芥cDNA文库中克隆了氢离子焦磷酸酶(H+-translocatinginorganicpyrophosphatase，H+-PPase)候选基因TsVP。该cDNA序列全长2759bp(Accessionno.AY436553)，包含100bp的5非翻译区(5UTR)和344bp的3’非翻译区(3UTR)以及一个2316bp的开放读码框(openreadingframeORF)。该读码框编码了771个氨基酸，含有14个跨膜结构域和H+-PPase基因所特有的5个保守结构域。 将盐芥TsVP基因在酵母盐敏感突变体(enal)中进行异源表达，可以提高酵母盐敏感突变体的耐盐性，这表明该基因是一个有功能的H+-PPase。在烟草中过表达TsVP基因可以提高烟草植株的耐盐性和耐旱性。正常条件下，TsVP基因转录水平及H+-PPase活性较高的两个转基因烟草株系维持了较低的溶质渗透势；在盐胁迫条件下，转基因烟草的叶盘和原生质体都表现出了较高的盐耐性，虽然这些转基因烟草植株的叶片中积累了较多的Na+，但是这些转基因植株有较高的生物量，其MDA含量和细胞膜损伤程度都显著低于野生型对照植株。这说明在烟草中过表达H+-PPase基因，可以增强植物细胞Na+区隔化能力，从而减少过量Na+对植物细胞的伤害；在干旱条件下，过表达TsVP基因降低了转基因烟草的溶质渗透势，从而使转基因植株保持了较高的相对水含量，提高了转基因烟草在干旱条件下的生存能力。 盐芥和拟南芥H+-PPase在氨基酸序列上有96﹪的相似性，为了比较盐芥和拟南芥来源的H+-PPase基因的功能，分别将这两个基因在酵母盐敏感突变体和烟草中进行异源表达，进而分析这两个基因对转基因酵母和转基因烟草耐盐性的影响，结果表明，TsVP和AVP1都可以提高转基因酵母和转基因烟草的耐盐性，而且二者提高酵母或烟草盐耐性的程度也没有明显差异。这表明来自盐芥和拟南芥的H+-PPase基因在生化功能上没有明显的差异。然而，在盐胁迫条件下，盐芥和拟南芥H+-PPase基因的表达模式存在显著不同，盐芥TsVP基因表达受到盐胁迫诱导，而拟南芥AVP1基因在盐胁迫条件下基因的表达水平没有显著的变化。为了进一步研究拟南芥和盐芥H+-PPase基因在盐胁迫条件下的表达调控机理，我们通过筛选盐芥基因组文库的方法克隆了盐芥TsVP基因的启动子序列，以盐芥和拟南芥基因组中H+-PPase基因与其上游连锁基因的基因间隔区作为TsVP基因和AVP1基因的启动子区域，通过NSITE-PL程序对这两个启动子序列进行生物信息学分析，发现盐芥和拟南芥H+-PPase基因的启动子序列在顺式作用元件的种类和数量上都存在极大的差别。盐芥TsVP基因启动子序列含有18个不同的顺式作用元件，拟南芥AVP1启动子序列含有27个(可以和25个不同调控因子相互作用)顺式作用元件。在这些预测的顺式作用元件中，其中只有6个顺式作用元件(RSP00079、RSP00377、RSP00420、RSP00635、RSP00644、RSP00653)为两个启动子序列所共有。而且在盐芥TsVP基因启动子序列中发现了多个在拟南芥AVP1基因启动子序列中不存在的胁迫相关的顺式作用元件，如G-box顺式作用元件：RSP00049，提示该基因的表达可能受到盐或干旱胁迫的诱导。这部分解释了造成TsVP基因和AVP1基因表达模式差异的原因。 盐芥Na+/Pi转运体基因克隆和功能研究 使用RACE等方法，克隆了盐芥Na+/Pi转运体基因。该基因cDNA序列全长1898bp(Accessionno.EF053057)，包含78bp的5’非翻译区(5UTR)和287bp的3’非翻译区(3UTR)以及一个1533bp的开放读码框(openreadingframeORF)。该读码框编码了510个氨基酸，含有10个跨膜结构域。将该基因与拟南芥磷转运体基因进行聚类分析，该蛋白与拟南芥磷转运体基因家族Pht1有较近的亲缘关系。通过生物信息学分析和GFP融合蛋白亚细胞定位分析，将该蛋白定位于植物细胞的叶绿体上。该基因主要在盐芥的叶中进行表达，而且受到盐胁迫和ABA的调控。为了进一步研究该基因在盐芥中的表达模式，通过筛选盐芥基因组文库的方法克隆了盐芥Na+/pi转运体基因上游2900bp的启动子区域，通过NSITE-PL程序对该启动子区域进行生物信息学分析，发现该启动子序列可能含有28个顺式作用元件，其中包括多个胁迫相关的顺式作用元件(RSP00055：ABREA、RSP00056：ABREBd、RSP00065：Em1a、RSP00066：Em1b、RSP00067：ABRE)。 将删除N-端66个氨基酸残基的盐芥Na+/Pi转运体基因的编码序列(cDNA序列)在酵母突变体PAM2中进行异源表达，可以抑制该酵母突变体在低磷培养条件下的酸性磷酸酶活性，而且大大促进该酵母突变体在低磷培养基上的生长速率。以完整的酵母细胞进行Pi转运实验，该基因的编码产物可以进行无机磷酸盐转运，而且低浓度的Na+(500μM)就可以激活该转运体的转运活性；当Na+浓度升高至2.5mM时，就可以充分激活该转运蛋白的转运活性(＞90﹪)。虽然Li+和K+在一定程度也可以刺激该转运体表现出Pi转运活性，但Na+是该转运蛋白的最佳一价阳离子激活剂。在酸性条件下(pH4.5-pH7.0)，该转运体蛋白最适pH=6.0，碱性条件下(pH7.0-pH9.5)该转运体蛋白最适pH=7.5，而且pH=7.5时的转运速率几乎是pH=6.0时的1.5倍。在这两个pH条件下进行该转运体蛋白的Pi转运动力学研究，结果表明该基因编码的转运体蛋白是一种高亲和Pi转运体，其Km分别为7.4μM(pH=6.0)和Km=8.7μM(pH=7.5)。 根据以上结果可以得出，拟南芥和盐芥直向同源基因AVP1和TsVP的cDNA序列相似性很高，在分别转入酵母和烟草后，对转基因生物的耐盐性提高程度相近，即TsVP基因和AVP1基因的生化功能相同，但在盐胁迫条件下，盐芥和拟南芥H+-PPase基因的表达模式存在显著不同，盐芥TsVP基因的表达在受到盐胁迫后大幅度上升，而拟南芥AVP1基因在盐胁迫处理下表达水平无显著变化，这提示TsVP基因在盐芥耐盐机制中起重要作用。比较分析AVP1和TsVP基因的启动子序列，发现它们所包含的顺式作用元件数目和种类差异较大，在盐芥TsVP基因启动子序列中发现了多个在拟南芥AVP1基因启动子序列中不存在的胁迫相关顺式作用元件，这不仅支持了TsVP基因在盐芥耐盐机制中起重要作用的假说，而且提示我们盐芥和拟南芥耐盐性的差异可能不是由它们直向同源基因的功能不同引起的，而更可能是基因表达调控网络差异造成的。 虽然拟南芥基因组中也存在有Na+/Pi转运体基因序列，但其功能一直未得到验证。在本工作中，我们克隆了盐芥的Na+/Pi转运体基因，进行了功能验证和转运蛋白Pi转运活性的研究，并将该转运蛋白定位于叶绿体上。该基因主要在盐芥的叶中进行表达，而且受到盐胁迫和ABA的调控。在其启动子序列中也发现了多个胁迫相关顺式作用元件。