雌雄配子结合形成受精卵的有性生殖过程,是开花植物的重要特征。其中植物雌配子体的发育过程主要包括三个阶段:首先,位于胚珠内亚表层的一个体细胞特化为大孢子母细胞(megaspore mother cell,MMC);其次,大孢子母细胞减数分裂形成功能大孢子;最后,功能大孢子经有丝分裂形成雌配子体。其中,体细胞向大孢子母细胞的特化标志着植物雌性生殖细胞发育的起始。植物通过何种方式来调控并确保只有一个体细胞成功分化为大孢子母细胞的分子机理尚不明确。前人研究发现RDR6基因突变会导致胚珠原基中出现多个大孢子母细胞。所以,本研究以大孢子母细胞数目发育异常的rdr6-11为背景材料,发现并证实了 基因以TREX蛋白复合物的形式,通过TAS3 ta-siRNA靶向调控生长素响应因子ARF3(AUXIN RESPONSE FACTOR 3)的途径,调控胚珠原基中体细胞特化为大孢子母细胞。具体实验结果如下:通过遗传筛选及基因定位,发现TEX1基因参与大孢子母细胞的特化。TEX1基因突变导致拟南芥胚珠内产生多个大孢子母细胞。进一步通过胼胝质沉淀检测及减数分裂细胞中特异表达蛋白(DMC1)的免疫荧光检测,发现tex1突变体胚珠中特化出的多个大孢子母细胞,但只有一个MMC可以进行减数分裂。进一步通过胚珠的透明观察以及与marker line杂交的实验发现,这些特化的细胞还存在于胚珠发育后期并具有配子体细胞的属性。构建TEX1与GFP的融合表达载体进行IEX1表达模式分析,发现TEX1在胚珠中的表达呈现动态变化。在大孢子母细胞特化发生阶段,TEX1在胚珠最外层体细胞内的细胞核中表达。在雌配子体发生阶段,TEX1特异性地在胚囊的细胞核中表达。随着胚囊的细胞化和进一步发育,TEX1在胚囊核中的表达沿着珠孔-合点轴(即沿着卵细胞、助细胞-中央细胞-反足细胞)逐渐消失。在拟南芥中,TEX1通常与HPR1和TH06等蛋白形成THO/TREX蛋白复合体参与生物过程的调控。本实验发现,HPR和1 THO6基因突变后的突变体胚珠中也产生了多个大孢子母细胞,且只有一个可以进行减数分裂,与tex1突变体的表型一致,说明TEX1调控大孢子母细胞特化是以THO/TREX蛋白复合体的形式发挥功能。由于TREX蛋白复合体与RDR6参与ta-siRNA的形成,本实验利用small RNA northern杂交检测了tex1和rdr6两个突变体材料中TAS3 ta-siRNA的表达量,结果表明TAS3 ta-siRNA合成受到抑制;进一步分析了拟南芥材料tas3突变体和TAS3 ta-siRNA不敏感的株系pARF3::ARF3m-GFP(该株系含有突变的 ARF3-ARF3m-TAS3 ta-siRNA失去对靶基因生长素响应因子ARF3的抑制作用),发现tas3突变体及pARFF3::ARF3m-GFP的胚珠中均产生多个大孢子母细胞。实验结果表明,TREX蛋白复合体与RDR6介导了 TAS3 ta-siRNA的合成,通过靶向抑制生长素响应因子ARF3的表达,进而调控大孢子母细胞特化。本研究进一步分析了TAS3 ta-siRNA介导下ARF3在胚珠中的表达模式。实验结果表明,在胚珠发育早期,不受TAS3 ta-siRNA调控的ARF3m的表达区域可延伸至胚珠外层的表皮细胞,而ARF3却只在胚珠合点区的内层细胞中表达。可见,TAS3 ta-siRNA能维持ARF3在胚珠合点区内层细胞中富集表达的特性。综上所述,本研究通过构建多系列遗传发育材料,筛选到了调控大孢子母细胞特化的基因TEX1,进一步证实了该基因以TREX蛋白复合物的形式与RDR6介导TAS3的生成,进而致使靶基因ARF3在胚珠合点区的内层细胞中特异表达,最终通过非细胞自主的方式调控胚珠原基中体细胞特化为大孢子母细胞。本研究揭示了 small RNA在植物雌性生殖细胞形成尤其是大孢子母细胞特化过程中发挥着重要的调控作用。