癫痫(epilepsy)是常见的神经系统慢性疾病之一,临床呈长期反复痫性发作的疾病过程,在儿童中发病率高,长期、频繁或严重的痫性发作会导致进一步的脑损伤甚至持久性神经精神障碍,给患者本人及家庭、社会造成很大的困扰。近年来,针对癫痫的病因、发病机制及治疗等的研究工作取得了很大进展,但是癫痫发生及发展的确切机制还未完全阐明。大量研究表明癫痫持续状态、脑外伤及缺血缺氧等脑损伤过程都伴有神经系统免疫炎症反应,而神经系统的免疫炎症反应可以增加神经元兴奋性,促进神经元损伤及癫痫发生。众多研究数据表明多种炎症介质参与了癫痫发生及发展过程,而抗炎治疗对部分类型的癫痫发作有效,可以减轻发作程度及神经病理学变化。高迁移率族蛋白1(high-mobility group box1, HMGB1)是一种高度保守的非组DNA结合蛋白,具有稳定核酸结构、调节转录和基因表达等多种生物学功能。近年来发现在一定因素作用下可以释放到细胞外发挥促炎因子作用,HMGB1可以由坏死细胞被动释放或由活化的免疫细胞主动释放,通过与其受体如Toll样受体4(toll-like receptor-4, TLR4), Toll样受体2(TLR2)和晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)等结合,激活核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)及其他信号传导通路,促进炎症因子及趋化因子的产生,从而发挥其促炎作用。TLR作为固有免疫受体,是近年来研究较多的一类受体,主要与感染细菌及内源性损伤相关分子结合发挥作用,其中TLR4是其中研究较热的受体之一,广泛分布于神经系统,包括神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞,参与多种神经系统疾病过程。研究证实HMGB1参与了败血症、关节炎、胰腺炎、呼吸障碍、脑缺血、脑外伤、脑炎等病理过程。而HMGB1的抑制剂如中和抗体,Box A等可以减轻多种疾病中HMGB1引起的炎症反应,发挥一定的保护作用,相反,给予重组HMGB1可以加重炎症反应及组织损伤。例如在败血症中给予HMGB1中和抗体可以减轻炎症反应,降低死亡率；在脑缺血和创伤性脑损伤中存在HMGB1的转位活化,给予HMGB1中和抗体可以抑制HMGB1活化及炎症反应,减轻脑损伤,而给予重组HMGB1可增加细胞因子合成,促进胶质细胞活化及加重神经元损伤。近来有研究表明在成年小鼠癫痫发生中有HMGB1/TLR4信号通路的参与,在热性惊厥儿童中也观察到血浆HMGB1水平升高。但是在未成年机体癫痫发作中是否有HMGB1的参与以及HMGB1中和抗体在癫痫发作中是否有神经保护作用仍不清楚,研究表明癫痫发生的易感性、神经病理变化及预后都存在年龄依赖性,而HMGB1的表达也在一定程度上受到年龄影响,因此在本课题中,我们通过侧脑室注射海人酸(kainic acid, KA)建立生后21天(postnatal day21, P21)大鼠癫痫持续状态(status epilepticus, SE)模型,研究SE后早期阶段(3h-7d), HMGB1/TLR4通路在海马组织中的表达特点以及神经元损伤特点；并通过给予HMGB1中和抗体阻断HMGB1活性,研究HMGB1中和抗体对癫痫持续状态后海马炎症因子表达,胶质细胞活化状态及神经元损伤情况的影响,以明确HMGB1在幼鼠癫痫持续状态中的表达特点及作用。第一部分：HMGB1/TLR4通路在幼年大鼠癫痫持续状态中表达变化的研究目的：研究海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态后海马HMGB1/TLR4通路的表达变化。材料与方法：1.幼鼠癫痫持续状态模型的建立及分组选用生后21天Wistar大鼠,水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立体定位仪。采用微量注射器缓慢将2nmol KA溶液(溶于1μl PBS)注入侧脑室(坐标为前囟后0.7mmm,中线外1.3mm,深度3.0mmm)。PBS对照组给予同等剂量PBS替代KA。痫性发作行为学评价根据Racine分级标准进行,持续全身发作或连续多次全身发作之间不能恢复正常状态超过30min者定义为癫痫持续状态(Racine分级Ⅳ-Ⅴ级),记录癫痫持续状态开始时间。在SE开始后2h给予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射终止发作。未达标准的大鼠予以剔除。SE大鼠随机分为SE后3h、6h、12h、24h、3d和7d组,同时设立正常组和PBS对照组(根据预实验结果选取时间点为注射后24h)2.采用尼氏染色和FJB染色观察神经元形态及损伤情况。3.采用免疫组织化学技术检测各组大鼠海马HMGB1和TLR4蛋白表达变化。4.采用Western blot方法检测各组大鼠海马HMGB1和TLR4蛋白表达变化。其中HMGB1蛋白检测又分为总蛋白和胞浆蛋白。5.采用免疫荧光双重标记技术检测各组大鼠海马HMGB1在各类细胞(神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞)中的分布变化。结果：1.海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态在海人酸注射后30min内,所有大鼠都出现呼吸急促、咀嚼、动须,点头、湿狗样抖动及前肢阵挛,之后逐渐出现旋转,站立,跌倒,强直阵挛发作。8%大鼠死亡,其中80%死亡出现于KA侧脑室注射后1h以内。观察大鼠癫痫持续状态发作2h后给予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射终止发作。而在PBS对照组无癫痫发作。2.海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态后海马神经元损伤尼氏染色和FJB染色显示正常组和PBS对照组大鼠海马无神经元损伤。SE后6h在CA3区和Hilus区开始出现神经元损伤,表现为尼氏染色阳性细胞数减少(P<0.01),并出现FJB阳性细胞,之后神经元损伤逐渐加重,SE后24h可见大量神经元损伤。而在CA1区明显的神经元损伤开始于SE后24h(P<0.05),3d明显(P<0.01),并且损伤较CA3区和Hilus区轻。3.海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态后海马HMGB1蛋白的表达变化Western blot分析显示海马HMGB1,总蛋白无明显变化,而胞浆HMGB1在SE后明显增加,开始于SE后3h(P<0.01),24h达高峰(P<0.01),之后逐渐降低,7d时仍高于正常组(P<0.05), PBS对照组与正常组无差异(P>0.05)。免疫组化显示在正常组大鼠和PBS对照组大鼠海马中,HMGB1主要分布于细胞核内,SE后3h开始出现于细胞浆中。在CA1区,SE后3h到12h,胞浆HMGB1主要出现于椎体细胞层中,在24h及以后,胞浆HMGB1在胶质形态细胞中增多。在CA3区和Hilus区,自SE后6h起可以观察到HMGB1染色缺失区域,该区域与尼氏染色和FJB染色显示的神经元损伤区域一致。4.海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态后海马HMGB1的细胞定位免疫荧光双标显示在正常组大鼠中,HMGB1位于神经元和星形胶质细胞细胞核内,无ED1阳性细胞。SE后6h,胞浆HMGB1主要出现于NeuN阳性的神经元细胞。SE后24h, HMGB1在胶质细胞中表达增多,并且星形胶质细胞表达HMGB1的比例及胞浆HMGB1阳性的星形胶质细胞明显增多(P<0.05),另外,出现ED1标记的小胶质细胞,主要表达于CA3区和Hilus区,分别有78.4±0.12%和81.2±0.08%的ED1阳性细胞与HMGB1共分布。5.海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态后海马TLR4蛋白的表达变化Western blot分析显示TLR4蛋白在正常组大鼠和PBS对照组大鼠海马中的表达量很少,而在SE后明显增加,开始于3h(P<0.01),24h达高峰(P<0.01),之后逐渐降低,7d时仍高于正常(P<0.01)。免疫组化结果显示在正常组大鼠和PBS对照组大鼠海马中,TLR4仅在部分大鼠有散在弱表达,SE后3h开始有表达,之后逐渐增多,在24h之前,TLR4阳性细胞主要分布于锥体细胞层,以神经元形态为主,在24h之后,出现在胶质细胞形态细胞中。结论：1.在海人酸侧脑室注射诱导P21大鼠癫痫持续状态后早期阶段,海马HMGB1/TLR4通路活化,并与神经元损伤相关。2. HMGB1的活化即核浆转位及胞外释放首先发生在神经元,随后出现于胶质细胞。第二部分：HMGB1中和抗体在幼年大鼠癫痫持续状态中的作用研究目的：研究HMGB1中和抗体对P21大鼠癫痫持续状态后海马炎症反应及神经元损伤的作用。方法：1.幼鼠癫痫持续状态模型的建立癫痫持续状态模型建立方法同第一部分。2.分组及药物干预SE大鼠随机分为模型组(KA+IgY组)和HMGB1中和抗体干预低、中、高剂量组(KA+anti-HMGB1组)。模型组通过侧脑室注射给予对照IgY (4μg),干预组分别给予HMGB1中和抗体1、2、4μg。给药时间为SE终止即刻及SE后12h。同时设PBS对照组,在相应时间给予对照IgY (4μg)。3.实时定量RT-PCRSE后6h取海马组织提取RNA,采用实时定量RT-PCR方法检测海马炎症因子白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-a) mRNA的表达变化。4.免疫组织化学SE后3d取脑组织制作石蜡切片,通过免疫组织化学方法检测海马Ibal、ED1和GFAP的表达变化。5.尼氏染色和FJB染色SE后3d,采用尼氏染色和FJB染色方法检测海马神经元形态及损伤情况。结果：1. HMGB1中和抗体对海马炎症因子的影响实时定量RT-PCR结果显示SE后6h,与对照组相比,KA+IgY组大鼠海马IL-1β和TNF-a mRNA表达明显增高(P<0.01)。而侧脑室注射中、高剂量中和抗体(2和4μg)可以明显抑制海马IL-1p和TNF-a mRNA表达(P<0.05),低剂量中和抗体(1μg)则无明显抑制作用(P>0.05)。2. HMGB1中和抗体对海马胶质细胞的影响免疫组织化学结果显示SE后3d,KA+IgY组大鼠海马小胶质细胞(Ibal和ED1)和星形胶质细胞(GFAP)免疫染色较对照组明显增强(P<0.01)。而侧脑室注射中、高剂量中和抗体(2和4μg)可以明显抑制海马Iba1、ED1和GFAP免疫染色强度(P<0.01),低剂量中和抗体(1μg)则无明显抑制作用(P>0.05)。3. HMGB1中和抗体对海马神经元损伤的影响尼氏染色和FJB染色显示SE后3d,对照组海马神经元形态正常,无损伤,KA+IgY组大鼠海马神经元损伤明显,表现为尼氏染色阳性神经元明显减少,而FJB染色阳性神经元显著增多(P<0.01),且CA3区、Hilus区较CA1区神经元损伤明显。而侧脑室注射中、高剂量中和抗体(2和4μg)可以明显减轻神经元损伤(P<0.05),低剂量中和抗体(1μg)则无明显作用(P>0.05)。结论：1.海人酸侧脑室注射诱导的P21大鼠癫痫持续状态可以促进海马炎症因子合成,胶质细胞活化及神经元损伤。2.侧脑室注射HMGB1中和抗体可以剂量依赖性的抑制海马炎症因子合成及胶质细胞活化,减轻神经元损伤,发挥神经保护作用。