蛋白酶A(EC3.4.23.6)是一种天冬氨酸族蛋白酶,由PEP4基因编码,可通过酵母的自溶或胁迫条件下的分泌而残存于成品啤酒中,从而分解纯生啤酒的泡沫蛋白而降低泡沫的稳定性。本文从检测啤酒泡沫蛋白的组成、探讨蛋白酶A对纯生啤酒泡沫的影响、跟踪生产中蛋白酶A的变化规律、构建蛋白酶A低水平或缺失的酵母突变菌株、筛选低蛋白酶A的酵母改良菌株及探讨其发酵性能等方面进行了系统的研究,旨在得到具有大生产应用潜力的纯生啤酒生产菌株,提高纯生啤酒的泡沫稳定性。啤酒中的蛋白质组成和含量是影响啤酒泡沫稳定性的主要因素之一,目前人们对泡沫蛋白组成的认识尚不统一。以往对啤酒泡沫蛋白的检测,大多局限于单向电泳、色谱、氨基酸分析等传统方法,但这些方法可能掩盖了性质相近蛋白的存在。本研究为探明啤酒泡沫蛋白的组成,除采用了传统的单向电泳和氨基酸分析技术外,还使用了双向电泳、MAIDI-TOF MS、LC/MS/MS等先进的检测技术对啤酒泡沫蛋白组成进行探讨。由组成氨基酸的分布规律和SDS-PAGE电泳检测可知啤酒泡沫不止含蛋白质Z和LTP1组成。双向电泳的检测,进一步了揭示啤酒泡沫蛋白组成的复杂性,发现纯生啤酒与其泡沫2蛋白分布相似,但含量和分布特点不同。利用MALDI-TOF MS对啤酒泡沫蛋白进行检测,虽然未得到期望的结果,但从中检测到糖基化LTP1的存在。利用LC/MS/MS,在啤酒泡沫中共检测到23种蛋白,除蛋白质Z和LTP1外,其它蛋白均未被报道。通过对比纯生啤酒与熟啤酒的泡沫变化规律,肯定了蛋白酶A是造成纯生啤酒泡沫不稳定的直接原因。青岛纯生啤酒生产菌株S.carlsbergensis 04-1和B在染色体水平上存在细微差异,二者使用代数对发酵液中蛋白酶A活力的影响趋势一致。第0代和1代的发酵液中蛋白酶A活力较低,2-4代酵母的蛋白酶A活力明显升高。将编码蛋白酶A的PEP4敲除是构建蛋白酶A低水平菌株或缺失菌株、解决纯生啤酒泡沫稳定性问题的有效途径。Lager啤酒酿造所用的S.carlsbergensis为四倍体,其编码蛋白酶A的基因序列和拷贝数不确定,需采用基因多重中断技术,才能得到蛋白酶A完全缺失菌株。本文构建了抗Zeocin的质粒pSH-Zeo,并以含抗G418基因的pUG6质粒为模板进行PCR介导的基因敲除,实现了工业菌株S.carlsbergensis转化子的显性筛选。进而将Cre-LoxP重组系统和PCR介导的基因中断技术结合,成功地敲除S.carlsbergensis的一个PEP4等位基因,然后将报告基因KanMX剔除,使突变菌株中不含任何外源基因,获得了基因安全性高的突变株pep4∷LoxP/PEP4。为避免相同PCR产物重复转化多倍体时引起的回复突变,提出采用缩进式敲除多个序列相同的等位基因、实现多重基因中断的观点。通过这种方式,成功地敲除了S.carlsbergensis的第二个PEP4等位基因,但由于S.carlsbergensis特殊的表达和调控机制,酵母在被敲掉第二个PEP4基因后不能生存。由此确定,青岛啤酒使用的S.carlsbergensis菌株中含有两个与S.cerevisiae的序列相同的编码蛋白酶A的PEP4等位基因、且对S.carlsbergensis的生存起关键作用。对得到的突变株pep4∷LoxP/PEP4进行筛选,主要参考发酵度和蛋白酶A活力指标,筛选出低蛋白酶A的改良菌株S.carlsbergensis 04-1-M和B-M。通过稳定性传代试验,证实pep4∷LoxP基因具有良好的遗传稳定性,从而保证了菌株的低蛋白酶A表达水平的遗传稳定性。改良菌株的特性与出发菌株相近,凝聚性较对应的原出发菌株略强。S.carlsbergensis 04-1-M的致死温度为51℃,而S.carlsbergensis 04-1、B、B-M的致死温度为52℃,蛋白酶A改良菌株和野生菌株有着相近的发酵性能和生理特性。在100 L中试应用试验中,改良菌株的低蛋白酶A特性被证实,具有工业化应用的潜力。发酵过程中,其在氨基酸和可发酵糖的利用、悬浮酵母数的变化、酵母形态方面与出发菌株表现相近,而其降糖速度略慢、发酵液中麦芽三糖的残留量略高、总氨基酸利用率略高。改良菌株终了发酵液的双乙酰、戊二酮、乙偶姻、乙醛含量均略高于对应的出发菌株,而醇酯比、发酵度、蛋白酶A活力均低于对应的出发菌株。改良菌株酿造出的啤酒柔和、协调、清爽、无异味。尽管如此,改良菌株在大生产应用之前尚还需做更多的实验验证。