第一部分:一种前路兔腰椎间植骨融合模型的建立一、背景介绍自1911年Hibb S首次报道脊柱融合(Spinal fusion)手术100多年以来,该种手术方式已经发展成为脊柱外科一种重要的手术方法。随着基础研究的进展及临床实践的应用,学者们发现脊柱融合手术仍存在一系列尚未得到解决的问题,如融合失败,椎体间假关节形成,自体骨来源缺乏以及自体骨取骨处并发症等。为了进一步探索研究脊柱融合的生理基础,解决由脊柱融合术导致的相关并发症。加之近年来,随着骨组织工程及生物工程的发展,为了测试各种新型合成的骨生物材料及生物因子的作用及效果,建立一种标准、稳定、有效的动物脊柱融合模型成为学者们研究的问题之一。相对于临床研究人为因素、不确定因素较多等局限性来说,基础动物研究能够有效的控制动物同一性,饲养条件及处理方式的统一性的优势,能够获得更加确切的实验数据。在动物选择方面,大型动物具有跟人相似的骨骼结构,获得的数据更加可靠及实用,主要用于生物力学及新型材料、器械的研究,比如羊、猪及猴子等。相比较小动物因为饲养方便,价格便宜,可以进行大量的试验动物研究,所以可以获得的大量的实验数据,统计结果更有意义。主要用于融合生理机制及过程的研究,如兔子、大鼠、小鼠,甚至应用到转基因鼠。兔是小动物中具有与人类腰椎解剖结构相似的动物之一,自1995年Boden等建立新西兰白兔脊柱后外侧融合模型以来,该模型被学者们广泛应用于测试不同骨生物因子以及组织工程新材料在脊柱融合中的作用。该模型具有手术操作简单,术后并发症少,可以提供足够的空间进行移植物的填充,便于获取足够的髂骨进行自体骨移植对照,具有与人类相似的融合率等优势。然而,该模型的最大缺点在于其融合部位位于横突或者椎板间,周围血管条件较差,其融合率较低。再者,目前在临床应用的脊柱融合手术方法中,主要以椎间融合术式为主。通过动物后外侧融合获得的试验数据不能很好的为临床研究采用。椎体间植骨融合模型是研究者们较少采用的研究模型,其主要原因为其手术操作较为复杂,容易损伤腹部脏器,导致严重并发症。再者是该模型破坏椎间隙后,椎体间缺乏稳定性,导致植骨块容易移位,造成椎间不融合。但是,该模型弥补了横突间植骨融合的劣势,真正模拟了临床手术路径及融合方式,获得的数据更加可靠。目前,仍未有像兔后外侧融合模型这样标准、统一的兔腰椎前路融合模型的制作方法的研究报道。二、目的1、利用兔腰椎骨性结构测量数据建立一种稳定的腰椎椎体间植骨融合模型;2、评价该兔腰椎融合模型的实用性、稳定性及有效性;为组织工程学研究提供一种标准化的模型参考。三、方法选用健康新西兰大白兔(2～2.5kg)44只,随机分为A、B、C、D四组。A组(n=10)用于解剖进行腰椎椎体测量,B组(n=12)行腰4/5椎体间椎骨融合术加内固定;C组(n=12只)行腰4/5椎体间植骨融合术未进行内固定,D组(n=10)行单纯显露加横突破坏。造模术后4周行X线检查,术后12周取标本进行大体观察、micro-ct、生物力学及组织学切片检查。四、结果仅出现1例因固定螺钉进入椎管导致脊髓损伤造成双下肢瘫痪。手触法检测B组融合率为100%(12/12),C组融合率为75%(9/12),D组标本未见椎间盘损伤及间隙破坏。影像学B组植入骨块位置明显优于C组,融合评分明显高于C组(p<0.05)。组织学提示B、C两组椎体间融合部位均可见新生软骨,C组中多件植骨块脱出后形成软组织空腔。生物力学显示B组最大载荷显著高于C组(p<0.05)。五、结论1、在兔腰椎解剖基础上进行兔腰椎间植骨融合模型制作保证了造模的安全性及可靠性。2、内固定装置可以为椎间植骨块提供稳定的融合空间,防止植骨块脱离融合位置,有助于提高该模型的融合效率,保证了该模型的有效性及实用性。第二部分:降解型柠檬酸羟基磷灰石复合体(POC-M-click-HA)材料在兔椎间融合模型中实验研究一、实验背景随着社会科技的进步,人民日常生活方式的改变。在我国,因创伤及退变导致脊柱不稳定,脊柱肿瘤以及脊柱感染性疾病发病率逐年增加。此类疾病若不及时干预,容易导致脊髓及神经根损伤,甚至导致瘫痪,大小便失禁等不可逆性的后果。目前,椎体次全切除、椎间盘切除椎间植骨融合已经成为治疗脊柱疾病的常用外科技术,椎间植骨材料的选择成为该手术成功的关键因素之一。因自体骨具有良好的骨诱导能力,同时避免了免疫排斥反应被认为是椎间植骨材料的“金标准”。然而,自体骨的来源不足,取骨处的并发症等一系列缺点限制了其广泛的应用,同时促生了各种骨生物替代材料的发展。在骨生物材料领域,学者们最早研究的是同种异体骨或动物骨骼,通过将这类骨头去抗原,灭菌处理后应用到人体当中,其缺点在于抗原的处理不彻底带来的机体免疫排斥反应,导致植骨不融合;骨骼供体本身所携带的疾病的传播及骨的质量较差等缺点。随着研究的进展,机械性金属材料,陶瓷材料,类似骨骼基质的羟基磷灰石材料,以及生物支架结合各种生物因子的复合材料逐渐被开发以及应用。但是各种材料都具有一定的不足之处,比如:机械强度不够,骨诱导能力较差,生物相容性不好等。为了改进生物材料的不足,学者们不断寻求一种理想的自体骨替代材料。研究发现在人体骨骼当中,柠檬酸含量显著高于其他的器官。柠檬酸(Citric Acid,亦称为枸橼酸)是一种有机弱酸,一种天然防腐剂,也用于向食物和软饮料中加入酸味。在生物化学中,它是三羧酸循环的重要中间产物,因此在几乎所有生物的代谢中起到重要作用。研究证明柠檬酸在骨代谢过程中发挥重要角色,柠檬酸复合物是骨骼中磷灰石纳米晶体结构的一部分。在人类骨骼中,该复合物覆盖了约磷灰石晶体的1/6,其含量约为骨骼有机物的5.5wt%,对骨骼中羟基磷灰石纳米结晶具有重要物理结合作用。美国宾夕法尼亚大学,生物工程及材料研究中心杨建团队根据柠檬酸在骨形成中的重要作用,利用体外合成的柠檬酸交联羟基磷灰石制备了可降解的骨生物材料。其中高强度的 biodegradable photoluminescent polymers-HA(BPLPs)对于大段骨缺损具有很好的修复作用,crosslinked urethane-doped polyesters-HA(CUPEs)在兔股骨外上髁缺损及大鼠颅骨缺损修补试验中表现出很好的生物相容性,骨诱导能力以及非常微弱的炎症反应。以上材料具有足够的生物学强度,然而在材料降解方面略显不足。进一步改善柠檬酸羟基磷灰石材料的不足,其团队利用甲基二乙醇胺(N-methyldiethanolamine,MEDA)交联柠檬酸羟基磷灰石(POC-HA),制备了 POC-M-click-HA生物支架,有利于其快速降解。为了进一步测试该材料的生物降解能力及优势,我们进行了一系列的体内、体外的试验研究。二、目的1、测试基于柠檬酸的火柴棒状快速降解型羟基磷灰石支架复合物(POC-M-click-HA)材料在兔椎间融合模型中的融合效果;2、评价该材料(POC-M-click-HA)与组织细胞的生物相容性,材料降解情况及骨诱导情况。3、通过比较该新型材料(POC-M-click-HA)与“金标准”自体骨及临床已经广泛应用骨生物材料(PLLA-HA),总结评价该新型材料的优势及不足。为该材料下一步开发及应用于临床提供初步的科学依据。三、方法1、选用健康新西兰白兔幼兔(4-5w)提取BMSCs细胞,利用贴壁培养方法获得纯化第三代兔BMSCs细胞,并与材料共培养3天,行扫描电镜观察,观察POC-M-click-HA材料与间充质干细胞的相容性。2、选健康新西兰白兔(2-2.5kg)54只,随机分为三组:A组为自体骨融合组18只,B组为聚乳酸羟基磷灰石复合物(PLLA-HA)材料融合组18只,C组为POC-M-click-HA材料融合组18只。术后4周、8周、12周根据SUK评估方法对大体标本的融合程度进行初步判断,利用X线、micro-ct、生物力学、组织学等方法进一步检测该生物材料的骨诱导情况,材料降解情况及生物学相容性。四、结果体外培养结果显示大量不规则BMSCs细胞贴附于POC-M-click-HA材料表面及空隙,细胞之间通过树突相互交联,分化、生长良好。术后伴随新生骨形成,POC-M-click-HA材料出现不同程度的降解。术后4周、8周时,POC-M-click-HA 材料组标本融合率(11.2±3.7,80±4.5)明显优于 PLLA-HA材料对照组(9.3±2.4and71.1±4.4,p<0.05),但低于自体骨融合组。术后12周,生物力学结果显示,POC-M-click-HA材料组标本最大载荷和刚度分别为880.8±14.5Nand 843.2±22.4N/mm,明显优于PLLA-HA对照组(712.0±37.5N,stiffness:622.5±28.4N/mm,p<0.05)。虽然最大载荷及刚度不及自体骨融合组,但两组间未有明显统计学差异。组织学切片结果可见POC-M-click-HA材料组新生骨面积较PLLA-HA对照组多,且组在POC-M-click-HA材料组在术后4周时出现部分材料降解,并形成散在的溶解后空腔。在术后8周时,椎间隙之间新生骨形成明显,占据材料降解空间,新生骨之间残存部分材料。术后12周时,椎间隙间可见连续新生骨连接上下椎体,材料近乎完全降解。相比PLLA-HA对照组在术后各个时间点也可见新生骨包绕材料生长,但新生骨面积低于POC-M-click-HA材料组,且降解速率不及POC-M-click-HA材料组。材料的降解可为新生骨提供充足的生长空间,增加椎间新生骨体积,提高了椎间融合的质量。生物力学结果同样验证由该生物材料诱导形成的椎间融合的生物力强度及刚度都优于PLLA-HA材料组。五、结论1、柠檬酸可降解POC-M-click-HA材料对于骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞未见明显毒性反应,与细胞相容性良好。2、柠檬酸可降解POC-M-click-HA材料具有良好的骨诱导能力及促进椎间骨生长能力;3、该材料具有良好的组织相容性,未见明显毒性反应及免疫排斥反应;4、该材料快速降解性质为新生骨的生长提供了充足的空间,同时避免了因为材料长期存在于体内产生的异物反应。5、生物力学结果显示该材料诱导形成的椎间融合具有接近于自体骨融合后的强度及刚度。综上:柠檬酸可降解POC-M-click-HA材料是一种良好的椎间植骨融合的骨替代生物材料。