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盐旱等非生物胁迫下,植物细胞中会产生大量的活性氧物质(Reactive Oxygen Species, ROS),引起严重的氧化伤害。植物通过漫长的进化形成了其自身复杂、高效的活性氧应答与清除机制。多数植物主要通过合成多种酶促和非酶促的活性氧清除剂来消除活性氧。黄酮类化合物是一类主要的非酶促的活性氧清除剂,在盐旱等胁迫下合成能力明显增强。黄酮类化合物(又称类黄酮)是一类低分子量次生代谢物,可分为黄酮醇和花青素等六大类。它们的抗氧性和在植物中的分布存在明显差异,其中黄酮醇的抗氧化性最强。现在,有关类黄酮耐逆作用的研究主要集中在总黄酮或花青素上,而特异分析黄酮醇的作用还未见报导。黄酮醇由黄酮醇合成酶(flavonol synthase, FLS)催化二氢黄酮醇合成的,拟南芥中共有6个FLS,其中FLS1活性最高,FLS1较低,其他几个没有活性。已有研究发现,FLS1突变体f1s10中黄酮醇含量明显降低,而FLS1过表达拟南芥中黄酮醇含量无显著变化。本实验室前期从小麦渐渗系耐盐抗旱品种山融3号(SR3)中克隆了一个FLS基因TaFLS1,其过表达拟南芥中积累了更多的黄酮醇。本论文以TaFLS1过表达拟南芥株系及flsl-3为材料,结合药理学分析,系统研究了黄酮醇在耐盐中的作用和生理基础。1.黄酮醇的富集提高拟南芥的耐盐性结果表明,与野生型相比,突变体f1s1-3幼苗的抗盐性明显降低,而TaFLS1过表达系幼苗的抗盐性明显提高。土壤中浇灌盐水实验表明,盐处理后野生型和突变体植株的生长受到严重抑制,其中突变体抑制更严重,接近死亡,而过表达系植株的生长状况明显较好。药理学分析显示,外源黄酮醇处理也提高了野生型和突变体幼苗及植株的耐盐能力。这些结果显示,黄酮醇提高植物的耐盐能力。在萌发阶段,盐胁迫下TaFLS1过表达系的萌发率明显高于野生型,外源黄酮醇也具有类似效应；但有趣的是,盐胁迫下突变体的萌发率也明显高于野生型,并与TaFLS1过表达系相似。为了分析黄酮醇提高耐盐能力与其抗氧化性的关系,我们利用NBT和DAB染色分别显示体内超氧根离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)的含量。结果表明,在盐处理下,与野生型相比,TaFLS1过表达株系叶片染色较浅,O2-和H2O2含量明显降低,相反突变体染色最深,两种ROS的含量最高。同样,外源黄酮醇处理也明显降低野生型和突变体中O2-和H2O2含量。结果说明,黄酮醇可以增强对活性氧的清除能力,降低了植物体内的活性氧积累水平,从而提高植物的耐盐性。2.黄酮醇的富集提高拟南芥对H2O2的抗性为了进一步验证黄酮醇与抗氧化能力的关系,我们分析了不同株系对外源H2O2处理的耐受性。结果显示,在拟南芥幼苗以及成苗阶段,与野生型相比,突变体flsl-3对外源H2O2的耐受性性明显降低,而TaFLS1过表达系则正好相反；外源黄酮醇处理也明显提高野生型和突变体的抗氧化能力。但在萌发阶段,与盐胁迫处理一样,突变体f1s1-3和TaFLS1过表达系的萌发率相似,均明显高于野生型。NBT和DAB染色结果表明,与野生型相比,TaFLS1过表达株系叶片中的ROS水平明显降低,而突变体则明显提高。3.黄酮醇降低对ABA的敏感性ABA是一种重要的胁迫应答相关激素,因而我们进一步分析了黄酮醇提高耐盐能力与ABA的关系。与野生型相比,TaFLS1过表达株系幼苗在ABA处理下的生长状态明显较好,而突变体相反,表明黄酮醇能降低对ABA的敏感性。外源施加黄酮醇也降低了野生型和突变体对ABA的敏感性。而在萌发阶段,与盐胁迫处理相似,突变体和TaFLS1过表达系的萌发率也高于野生型,并且突变体的萌发率甚至还高于过表达株系。以上结果初步表明,黄酮醇可以通过提高ROS清除能力提高耐盐能力,小麦黄酮醇合成酶TaFLS1是一个作物耐盐(逆)分子育种的候选基因。