论文部分内容阅读
越来越多的实验研究和临床研究已证实，各种肾脏疾病进展为终末期肾衰的速度并非取决于肾小球损伤及肾小球硬化的程度，而主要与肾小管间质损伤及肾间质纤维化（Renal Interstitial Fibrosis，RIF）的程度密切相关。肾小管间质损伤时，肾小管上皮细胞（Tubular Epithelial Cell，TEC）并非仅仅是被动的受害者，更是积极的参与者。尽管目前对TEC在RIF中的作用有了一定的认识，但其中许多详细的机制及环节尚很不清楚，因此，努力探讨TEC在RIF发生发展中的作用机理并积极寻找以TEC为靶点的新型的抗肾纤维化药物是目前肾脏病研究者的热门话题。 核转录因子AP-1的活化在肾脏疾病中的作用已逐渐受到人们的关注。为数不多的体内外的研究已初步表明，AP-1在肾小管上皮细胞的活化，炎症介质产生中起着重要作用。因此，我们设想从基因水平特异性地阻断TEC内AP-1的活性以减轻肾间质的炎性损伤及纤维化进展。Decoy核酸技术作为一个新的基因治疗策略，可特异性地阻断核转录因子的活性而抑制下游基因的表达，也极可能成为有效治疗肾脏疾病的新方法。为证实我们的设想，并为利用AP-1 decoy寡核苷酸（ODN）类药物治疗肾小管间质病变提供理论依据和技术基础，本研究借助阳离子脂质体介导的基因转染技术，首次应用AP-1 decoy ODN竞争性地封闭近端肾小管上皮细胞（Proximal Tubular Epithelial cell，PTEC）中AP-1的转录活性，进行了以下三个方面的研究。南京医科大学博士学位论文上皮细胞内AP一1活性的影响，探讨AP一1在肾小球肾炎及肾小管间质纤维化发病机制中的作用。方法:采用免疫组织化学技术分别检测AP一1亚单位c一Jun和TGF一p，在增殖性和非增殖性肾小球肾炎及正常肾组织中的表达，应用真彩色医学图像分析系统分析c一Jun表达与肾小球或’爵J.管间质损伤的关系。利用体外培养的猪近端肾小管上皮细胞（LLC一PKI），应用凝胶电泳迁移率（EMSA）及叭触stem blot检测TNF一a，诱导的LLC一PKI细胞核内AP一1的活性变化及”一1蛋白表达;应用超迁移率实验（GSA）检测AP一1二聚体中c一Jun和c一Fos成分的变化。结果:（1）正常肾组织可组成型表达c一Jun，主要位于肾小球内皮细胞和包曼氏囊上皮细胞，肾小球系膜细胞中表达较少;肾小管则主要见于近端肾小管上皮细胞。病理状态下，c一Jun表达上调，。一Jun在有慢性进展性病变（肾小球硬化或/和肾小管间质纤维化）肾组织中的表达明显强于急性可逆性病变（增殖性病变和渗出性病变等）的肾组织;c一Jun在肾小管间质部位的表达明显强于肾小球。（2）肾小球内e一Jun的表达强度与肾小球中TGF一p:的表达强度无明显相关性;’爵J、管内c一Jun的表达强度与’爵卜管中TGF一pl的表达强度呈显著正相关;（3）在正常培养状态下，LLC一PKI细胞核内有”一1蛋白表达，但活性较低。TNFa:可呈剂量依赖性的方式促进AP一1 DNA结合活性以及c一Jun和c一Fos的蛋白表达。TNFa:激活AP一1二聚体成份中的c一Jun和e一Fos（以e一Jun为主）。结论:TNF一a:在近端肾小管上皮细胞内AP一1活性和蛋白表达的调控中发挥重要作用。病变的肾组织中”一1的表达增加可能是由于炎性介质活化肾脏固有细胞所致;肾小管间质中AP一1的表达明显强于其在’爵卜球中的表达并与TGF一p:表达呈正相关。这些研究结果表明’爵卜管上皮细胞内AP一1转南京医科大学博士学位论文录途径的激活可能在肾小管间质纤维化的进展中起着重要的作用。第二部分、AP一ldecoy寡核昔酸对肾小管上皮细胞生物学行为的 影响目的:确定阳离子脂质体介导AP一1 deeoy寡核普酸转染体外培养的肾小管上皮细胞的最佳效率;探讨AP一1 decoy ODN对体外培养的猪肾小管近端上皮细胞（LLC一PKI）增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响;阐明AP一1在肾小管近端上皮细胞增殖及凋亡中的作用及AP一1 deeoyODN基因治疗的作用机理。方法:人工合成AP一1 decoy0DN，并经全程硫代磷酸化修饰及荧光素FAM标记。分别将有或无脂质体介导AP一1 deeoy ODN转染体外培养的猪近端肾小管上皮细胞（LLC一PKI），应用激光共聚焦显微镜观察AP一1 deeoy ODN在肾小管上皮细胞内的分布，通过流式细胞仪观察AP一1 deeoyODN的最佳转染效率。分别用’H胸腺喀吮（3H一TdR）掺入法、四甲基偶氮吐蓝（MTT）掺入法及细胞计数检测AP一1 deeoy ODN转染肾小管上皮细胞对其细胞增殖的影响;用流式细胞仪观测AP一1 decoy ODN转染肾小管上皮细胞对其细胞周期及细胞凋亡的调控。结果:（1）”一1 decoyODN转染LLC一PKI细胞后可分布于胞浆及胞核内，无脂质体介导的AP一1 decoy oDN主要分布于细胞浆;而脂质体介导的AP一1decoy ODN大部分进入胞核;无脂质体介导的AP一1 decoy ODN转染细胞6h的阳性率为39.22%，18h达高峰80.73%。脂质体介导的AP一1 decoy ODN转染6h后细胞的摄取率即达86.28%，18h达97.93%，24h转染率达高峰99.440，0，36h仍维持于高峰平台（95.39%）;无脂质体介导Ap一1 deeoy ooN转染细胞6h的荧光强度为142.09，18h达高峰358.00。脂质体介导的妙一1南京医科大学博士学位论文deeoy ODN转染6h后细胞的荧光强度为1 74.77，1 sh达579.17，24