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为了明确p27缺失对小鼠生长发育和骨形成的影响,我们比较分析了 WT和p27-/-小鼠的表型差异。结果显示:与WT小鼠相比,p27-/-小鼠体型、体重、胫骨骨密度、总胶原阳性面积和骨小梁容量均明显增加。通过HE、ALP组织化学和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色证明小梁骨成骨细胞数、ALP和Ⅰ型胶原阳性面积以及成骨细胞骨形成相关基因表达水平在p27-/--小鼠均明显增加。TRAP组织化学染色发现破骨细胞面及RANKL与OPG mRNA比值在p27-/-小鼠无显著性改变。这些结果说明p27基因缺失通过促进成骨细胞骨形成而增加了骨量。为了明确p27基因缺失促进骨形成的机制,我们利用全基因组表达谱基因芯片分析了同窝2周龄WT与p27-/-小鼠长骨骨组织基因表达谱的差异。结果发现p27-/-小鼠骨组织中Shh信号通路分子,包括Shh、Gli1/2/3和Bmi1均上调,而Shh信号通路负性调控分子Sufu和Ptch1均下调。利用实时荧光RT-PCR和Western-blot方法验证了芯片结果。这些结果提示p27缺失引起的成骨细胞骨形成增加可能与Shh信号通路激活有关。为了证明这种可能,我们使用Shh信号通路抑制剂KAAD-Cyclopamine分别处理WT和p27-/-小鼠来源的BM-MSCs,对形成的成纤维细胞集落进行甲基蓝染色和ALP细胞化学染色,通过图像分析CFU-f和ALP阳性CFU-f面积的变化。结果显示CFU-f和ALP阳性CFU-f面积在p27-/-小鼠较WT小鼠明显增加,而在拮抗剂处理组较对照组明显降低,在p27-/-小鼠与WT小鼠处理组间无明显差异。这些结果说明p27基因缺失能够通过激活Shh信号通路,促进骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化。为了在体证明p27基因缺失是否通过激活Shh信号通路,促进成骨细胞骨形成,通过灌胃给予同窝3周龄WT和p27-/-小鼠Shh信号通路特异性抑制剂Vismodegib,2周后收集小鼠的长骨提取mRNA和蛋白,检测发现抑制剂Vismodegib可使WT和p27-/-小鼠Shh信号通路和成骨相关基因及蛋白表达均明显下调。利用Micro-CT扫描、总胶原组织化学、HE染色、ALP、Ⅰ型胶原(Col-I)免疫组织化学染色等方法比较分析了给药组与对照组的骨骼表型差异。结果显示:骨容量、成骨细胞数、碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原阳性面积在给药组均明显较对照组显著降低,在p27-/-小鼠给药组降低更为明显。这些结果说明p27缺失能够通过激活Shh信号通路,促进成骨细胞骨形成。先前的研究已经证明p27能够与E2F4形成复合物共同作用抑制某些基因转录。为了明确p27是否能够与E2F4共同作用发挥抑制Shh表达的作用,我们通过检索获得Shh基因启动子序列,定位于701bp(-550~+151 bp)的区域,软件预测发现Shh基因的启动子区域存在转录因子E2F4的结合位点。我们利用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法证明了 E2F4能够与Shh启动子区域结合。凝胶电泳迁移实验(EMSA)结果证明转录因子E2F4能特异性地与Shh启动子区域结合。双报告基因活性检测证明在WT和p27-/-细胞中,转录因子E2F4均能负性调节Shh基因启动子的活性,而在p27缺失细胞中的调节幅度更大。为进一步证实转录因子E2F4对Shh基因启动子活性的负性调节作用,我们将E2F4 shRNA和过表达质粒分别转染MEFs细胞检测Shh蛋白的表达,结果证明转录因子E2F4敲低能上调Shh蛋白的表达,而E2F4过表达能抑制Shh蛋白的表达。这些结果说明p27能够与E2F4协同作用抑制Shh的表达。为了明确Bmi1基因敲除在阻断p27缺失激活的Shh信号通路中的作用,我们建立了 Bmi1和p27双基因敲除(Bmi1-/-p27-/-)小鼠模型,比较分析它们与同窝单基因敲除及WT小鼠的骨骼表型差异。结果发现:与p27-/-小鼠相比,Bmi1--p27-/-小鼠生存期显著缩短,体重、骨量、成骨细胞数、碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原阳性面积及成骨细胞相关基因均明显降低,这些参数与Bmi1-/-、鼠无明显差异。这些结果说明Bmi1因敲除能够阻断p27缺失引起的成骨细胞骨形成增加。为明确Bmi1基因敲除对p27缺失引起的Shh信号通路激活效应的影响,我们使用Shh信号通路激动蛋白Shh-N或拮抗剂KAAD-Cyclopamine分别处理WT、Bmi1-/-、p27-/-及Bmi1-/-p27--小鼠来源的BM-MSCs,利用MTT的方法检测细胞增殖水平的变化。结果发现:激动蛋白Shh-N以剂量依赖性地促进WT和p27-/-小鼠来源BM-MSC增殖,而对Bmi1-/-和Bmi1-/-p27-/-小鼠来源的BM-MSC细胞增殖无明显刺激作用;相反,拮抗剂KAAD-Cyclopamine以剂量依赖性地抑制WT和p27-/-小鼠来源BM-MSC增殖,而对Bmi1-/-和Bmi1-/-p27-/-小鼠来源的BM-MSC增殖无明显抑制作用。同时,通过使用Shh信号通路激动剂Shh-N处理培养的WT和Bmi1-/-小鼠来源的BM-MSCs。结果发现:与对照组培养相比,CFU-f和ALP阳性的CFU-f形成效率在Shh-N处理的WT小鼠来源的BM-MSC培养明显增加,但是在Shh-N处理的Bmi1-/-小鼠来源的BM-MSC培养则无显著性差异。这些结果说明Bmi1是p27缺失激活的Shh信号通路的主效基因。为了研究Bmi1作为关键效应分子通过阻断Shh信号通路发挥抑制骨肿瘤发生发展的作用,我们首先利用Real-time RT-PCR检测了 p27、Shh及Bmi1在三种人源骨肉瘤细胞株(Saos2、MG63、U20)中表达水平的变化,以正常的人成骨细胞(hFOB)作为对照。结果显示:与正常人成骨细胞相比,在三种骨肉瘤细胞中p27基因表达水平均显著下调,而Shh和Bmi1基因表达水平均显著上调。为了明确Bmi1基因敲低对骨肉瘤细胞增殖的影响,我们构建了 Bmi1shRNA慢病毒质粒,分别转染三种骨肉瘤细胞株Saos2、MG63和U20S,抗性筛选,获得Saos2、MG63和U20S的Bmi1shRNA稳转细胞株。结果显示:Bmi1shRNA显著下调Bmi1在Saos2、MG63和U20S细胞中的表达,并明显地抑制了它们的克隆形成效率。这些结果表明Bmi1基因敲低能够明显地抑制骨肉瘤细胞生长。为了明确Bmi1基因敲低对骨肉瘤移植瘤生长和细胞增殖能力的影响,我们将空载及Bmi1基因敲低的稳转细胞株分别接种于6周龄裸鼠腋下,在接种部位先后出现点状骨肉瘤瘤体,观察测量肿瘤体积的变化。结果显示:与空转细胞相比,Bmi1基因敲低可明显抑制骨肉瘤细的生长速度,肿瘤体积明显减小。同时我们利用Ki67免疫组织化学染色比较分析了各组裸鼠移植瘤组织中Ki67阳性细胞百分率的变化。结果显示:Saos2、MG63和U20S的Bmi1shRNA稳转细胞株中Ki67阳性细胞百分率较空转细胞明显降低。这些结果证明Bmi1基因敲低能够通过抑制骨肉瘤细胞增殖,发挥抑制其生长的作用。本研究结果证明了 Bmi1是p27基因缺失引起Shh信号通路激活的关键效应分子。这些结果说明不仅通过上调Bmi1能够防治骨质疏松,而且通过抑制Bmi1能够防治Shh信号通路激活引发的肿瘤,包括骨肉瘤。