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根据本实验室提交的鸭圆环病毒（DuCV） GH01株基因序列信息,设计针对DuCV Capsid （Cap）基因的特异性引物,以实验室保存病料为模板,对DuCV GH01株Cap基因进行PCR扩增,并且开展了：DuCV GH01株Cap基因特征分析、截断Cap基因进行原核表达,并对重组表达蛋白进行亲和层析纯化,以Cap蛋白作为包被抗原,建立了检测DuCV抗血清的间接ELISA方法,结果如下：1. DuCV Cap基因的克隆及分子特征分析利用PCR方法对DuCV GHO1株Cap基因全长进行扩增,构建Cap基因的T克隆重组质粒并进行酶切鉴定,测序正确后对Cap基因及其编码Cap蛋白进行特征分析。结果表明：通过PCR扩增获得DuCV完整Cap基因,并成功构建T克隆质粒（pMD18-cap）,测序分析表明,Cap基因全长大小为774bp,编码蛋白为257aa,分子量为29.7kDa,等电点（PI）为10.79；编码的Cap蛋白有一个保守结构域,属于Circoviruscapsid家族：含有3个糖基化位点,21个磷酸化位点,5个可能的抗原表位,分别位于1～39、60～85、96～116、129～180、211～243等区域；无信号肽、跨膜区；二级结构预测其无规则卷曲较多,三级结构预测显示其同源建模只有一个合适模型,为猪圆环病毒Cap蛋白。系统进化树分析表明,鸭圆环病毒GH01株与番鸭FJFQ315株亲缘关系最近,与鹅圆环病毒及天鹅圆环病毒亲缘关系较近,与鸡传染性贫血病毒关系较远。Cap基因密码子使用分析显示,存在密码子偏嗜性,其中GGG、CAA、 AAG、TTA与TCA使用频率为零；亚细胞定位预测结果显示,DuCV Cap蛋白主要定位于细胞核区域。2. DuCV截断Cap基因的克隆、原核表达及蛋白纯化根据实验室提交的DuCV GH01株完整Cap基因序列设计了针对截去核定位信号的截断Cap基因引物序列,以实验室保存病料为模板,对截断Cap基因进行PCR扩增,并将扩增的截断Cap基因克隆到pMD18-T载体上,经双酶切和测序鉴定正确后,克隆到表达载体pET-32a（+）,将获得的重组表达质粒转入表达菌Rosetta,通过对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间的优化,确定最佳表达条件并进行大量诱导表达,表达重组Cap蛋白经Ni-NTA柱亲和层析纯化,收集洗脱液,测定纯化蛋白浓度,利用SDS-PAGE分析纯化效果。结果表明：扩增出预期大小为567bp的DuCV GH01株截断Cap基因片段,且能成功连接到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET32a-cap;经过诱导条件的优化,最终确定了蛋白表达的最优条件为：在30℃、IPTG诱导浓度为O.8mmol/L条件下诱导16h,蛋白表达量达到最高值：重组Cap蛋白以包涵体的表达形式存在,大小约为39kDa。纯化后的重组蛋白条带较清晰,浓度约为1.5mg/mL,DuCV Cap蛋白的成功表达为后续试验奠定了坚实的基础。3.以Cap重组蛋白作为包被抗原检测DuCV抗血清的间接ELISA方法的建立与应用通过对最佳抗原包被浓度、血清最佳稀释倍数、最佳包被条件、封闭时间及最佳酶标抗体稀释倍数的优化,确定间接ELISA方法最佳工作条件,确定阴阳临界值,并对间接ELISA方法的特异性、敏感性和重复性进行检测,最后通过临床样本的检测,比较本研究建立的间接ELISA方法和传统PCR检测方法的符合率。结果显示,本试验建立的间接ELISA方法的最佳工作条件为：抗原最佳包被浓度为4μg/孔,血清最佳稀释倍数为1：40,包被条件为37℃包被1h后放入4℃冰箱包被过夜,封闭时间为1% BSA 37℃封闭1h,最佳酶标抗体稀释倍数为1：800,阴阳临界值为0.352。建立的间接ELISA方法检测其他鸭源病原血清时结果显示均为阴性,敏感性结果显示敏感度达到1：2560,重复性检测组间和组内变异系数均小于10%,建立的间接ELISA方法具有很好的特异性、敏感性和重复性。对59个临床样本进行检测,结果表明,PCR方法检测出阳性样本数为45个,间接ELISA方法检出阳性样本数为43个,阳性检测符合率为95.6%。