鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)主要是侵害宿主的免疫系统,而导致宿主免疫力低下,进而引发二重或多重感染,可给养殖业造成极大经济损失。然而由于DuCV发现较晚,又缺乏体外培养DuCV的方法,因此对其致病机理及危害的研究尚存在很多困难。为了解DuCV在广西鸭群中流行和变异,以及危害程度,明确广西DuCV的基因型及优势基因型,并为创建研制DuCV抗体快速检测方法奠定基础。本研究拟从广西DuCV遗传变异分析及Cap蛋白的原核表达两个部分对广西DuCV进行研究和分析。1、广西DuCV遗传变异分析本研究采取PCR扩增方法对2010～2012年间广西9市鸭群中2569份内脏组织样品进行了检测,检测出阳性样品194份,阳性率为7.55%。其中,筛选部分阳性样品进行基因组扩增和比对分析,共获得14个DuCV全基因组序列。基因组大小为1993nt～1995nt,与已报道的其他DuCV毒株基因组大小一致。14个DuCV广西毒株彼此之间的同源性为93.5%～99.8%,与德国、美国、韩国分离株以及24个中国大陆毒株的同源性为92.2%～99.6%,而与另外18个大陆地区毒株和4个台湾毒株同源性仅为82.3%～86.2%。DuCV基因组内包含3个主要的开放阅读框(Open reading frame, ORF):ORFV1/rep、ORF C1/cap和ORF C2,所有14个广西毒株在上述编码区没有核苷酸插入或者缺失现象。这14个广西毒株Cap基因(ORFC1)长度均为774nt,编码257个氨基酸。核苷酸序列同源性为89.5%～99.9%,氨基酸序列同源性为95.3%～100.0%。ORF C2长度均为237nt,编码78个氨基酸。核苷酸序列同源性为96.6%～100.0%,氨基酸序列同源性为91.1%～100.0%。Rep基因(ORF V1)长度均为879nt,编码292个氨基酸。核苷酸序列同源性为95.9%～99.7%,氨基酸序列同源性为98.3%～100.0%。基于DuCV基因组遗传进化树分析显示存在两个明显的分支即：基因1型与基因2型。基因1型存在三个亚型即：基因1.1亚型、基因1.2亚型和基因1.3亚型。其中基因1.1亚型主要包括22个中国大陆毒株及一个德国毒株,基因1.2亚型则包括14个中国大陆毒株、一个美国毒株33753-52和4个韩国毒株,基因1.3亚型包括两个中国大陆的毒株LJ07和LJ33。而基因2型也存在三个亚型即：基因2.1亚型、基因2.2亚型及基因2.3亚型。其中基因2.1亚型包括中国台湾的四个毒株,基因2.2亚型为15个中国大陆毒株,基因2.3亚型为三个中国大陆毒株MH02-07、 MH11、HZ09。本研究所获得的14个广西毒株均属于基因1型,其中QZ37-2012、QZ04-2011、LZ11-09、FC35-2012、QZ36-2012、TD41-09、 FC33-2012、FC34-2012、FC32-2012、NN13-2012归属于基因1.1亚型,LZ01-2011、NN11-2012、NN12-2012、PX08-2011归属于基因1.2亚型。2、DuCV Cap蛋白的原核表达使用Gene Designer2.0软件(DNA2.0inc公司)对Cap基因进行分析和密码子优化,并在首尾分别加入BanH I和Sal I位点,且去除基因内部其余常见酶切位点。经BanJ I和Sal I酶切获得了Cap基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了DuCV Cap基因重组表达质粒pET-32a-Cap。将重组质粒转化入BL21(DE3)株感受态细胞,在终浓度为0.1mmol/L的诱导剂IPTG中进行诱导表达,37℃250r/min振摇培养诱导4h。SDS-PAGE电泳分析结果显示Cap蛋白获得成功表达,融合蛋白的分子质量约为48ku,表达的重组蛋白占菌体总蛋白的43.1%,主要以包涵体形式存在。Western Blot检测显示该融合蛋白可以被针对His标签蛋白的抗体所识别。利用镍离子亲和纯化株进行对重组蛋白进行了纯化,获得纯度为92.3%的重组蛋白。