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研究背景上世纪八十年代末期,穿支皮瓣的出现为临床显微外科和皮瓣外科的发展开拓了新的领域。Taylor指出相邻穿支体间通过Choke vessels相吻合,且其吻合有不减少口径的真性吻合、逐渐减少口径的阻塞性吻合和在正常情况下尚未开放的潜在性吻合三种方式。临床上可行跨区皮瓣切取来修复单穿支血管体皮瓣无法覆盖的大面积皮肤缺损,包含三穿支体区的跨区皮瓣中,第一穿支的血流流经一、二穿支间的ChokeI区和二、三穿支间的ChokeII区供应末梢皮瓣。研究发现,第一穿支的血流可通过ChokeI区血管的扩张安全到达第二穿支体区,但第三穿支体区皮瓣的成活却无法保证,第三穿支体区的坏死与ChokeII区有关,ChokeII区是血流阻力的分水岭。NO是皮瓣术后小动脉扩张和皮瓣灌注的重要因素,其含量对皮瓣血流和成活率都很重要,而且皮瓣术后组织产生的NO会优势集中在皮瓣内。本实验建立了大鼠背部跨区皮瓣模型,以期明确NO对穿支皮瓣术后ChokeII区的影响和皮瓣远端坏死面积的关系。研究目的明确NO促进穿支皮瓣术后ChokeII区血管增生和扩张的机制和对皮瓣成活率的影响。研究方法雄性SD大鼠108只,按注射药物不同分为三组,每组36只。L-Arg组:术后即刻、术后1~7天腹腔注射L-Arg 400mg/(kg·d);L-NAME组:术后即刻、术后1~7天腹腔注射L-NAME40mg/(kg·d);空白组:于相同时间点腹腔注射等量生理盐水。三组大鼠均制作以左侧髂腰动脉穿支为蒂的三穿支体跨区皮瓣。(1)术后7天,观察三组皮瓣成活状况,测量皮瓣成活面积并计算皮瓣成活率,观察皮瓣内血管分布和走形;(2)术后即刻、术后1、3、5、7天,切取Choke I区和ChokeII区组织标本,运用硝酸还原酶法测定组织内NO含量;(3)术后7天,运用颈总动脉灌注明胶-氧化铅行皮肤血管造影,观察三组皮瓣血管新生和吻合情况;(4)术后7天,切取ChokeI区和ChokeII区组织标本,4%多聚甲醛溶液充分固定,石蜡包埋切片,行HE染色,显微镜下计数微血管密度并测量微血管管径;(5)术后3天、7天,取ChokeII区组织标本,4%多聚甲醛溶液充分固定,石蜡包埋切片,运用免疫组织化学染色法半定量检测VEGF、ICAM-1、MMP-2、CD11b的表达;(6)术后3天、7天,取ChokeII区组织标本,充分研磨裂解,离心后取上清液,运用蛋白印迹法定量检测VEGF、ICAM-1、MMP-2的表达。研究结果(1)术后7天三组ChokeI区血管都达到真性吻合,L-Arg组管径较粗;L-Arg组ChokeII区新生血管较多,皮瓣末端血管结构较完整,空白组ChokeII区新生血管较少,L-NAME组皮瓣末端发黑坏死,观察不到血管结构;L-Arg组大鼠皮瓣成活率显著高于空白组(t=4.666,P=0.001)和L-NAME组(t=8.045,P<0.001),空白组大鼠皮瓣成活率显著高于L-NAME组(t=3.289,P=0.009)。(2)L-Arg组和空白组Choke区NO含量变化趋势基本一致,术后即刻开始升高,3天达到高峰,后逐渐下降,各时间点两组差异比较有统计学意义(P<0.05),L-NAME组ChokeI区术后1天NO含量大幅下降,后在小范围内波动,ChokeII区术后3天内NO含量大幅下降,后在小范围内波动,Choke区各时间点NO含量与L-Arg组和空白组两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)术后7天,L-Arg组ChokeI区和ChokeII区血管结构较完整,走形清楚,扩张达到真性吻合的血管沿着皮瓣纵轴方向一直延伸到皮瓣末端;空白组和L-NAME组ChokeI区血管结构较完整,L-NAME组血管扩张不及L-Arg组和空白组明显,ChokeII区血管结构和走形杂乱,L-NAME组皮瓣末端血管结构消失。(4)术后7天,三组ChokeI区MVD两两比较差异无统计学意义(P>0.05);L-Arg组ChokeII区MVD明显高于L-NAME组(t=8.821,P<0.001),空白组ChokeII区MVD明显高于L-NAME组(t=4.038,P<0.001)。术后7天,三组ChokeI区微血管管径两两比较差异无统计学意义(P>0.05);L-Arg组ChokeII区微血管管径明显高于L-NAME组(t=7.496,P<0.001),空白组ChokeII区微血管密度明显高于L-NAME组(t=5.064,P<0.001)。(5)术后3天、7天,免疫组织化学染色检测三组皮瓣ChokeII区VEGF、MMP-2、CD11b和ICAM-1表达情况,结果显示:术后3天和7天,L-Arg组和空白组VEGF、MMP-2均明显表达,L-Arg组表达较强,L-NAME组VEGF表达较弱;术后3天,三组CD11b均较明显表达,术后7天,L-NAME组和空白组CD11b均明显表达,L-NAME组表达较强,L-Arg组CD11b表达较弱;术后3天,三组ICAM-1均较明显表达,L-Arg组和空白组表达较强,术后7天,L-NAME组和空白组ICAM-1均明显表达,L-NAME组表达较强,L-Arg组ICAM-1表达不明显。(6)Western blot方法检测三组皮瓣ChokeII区VEGF、ICAM-1和MMP-2表达情况,术后第3天结果显示:空白组和L-Arg组VEGF表达量显著高于L-NAME组[(t=3.329,P=0.014),(t=4.76,P=0.005)];空白组和L-Arg组ICAM-1表达量显著高于L-NAME组[(t=26.465,P<0.001),(t=28.566,P<0.001)];空白组MMP-2表达量与L-NAME组相比差异无统计学意义(t=0.283,P=0.789),L-Arg组MMP-2表达量显著高于与L-NAME组(t=4.053,P=0.010)。术后第7天结果显示:空白组和L-Arg组VEGF表达量显著高于L-NAME组[(t=2.61,P=0.048),(t=3.836,P=0.012)];空白组ICAM-1表达量显著高于L-NAME组(t=-2.766,P=0.04),L-Arg组ICAM-1表达量与L-NAME组相比差异无统计学意义(t=-0.751,P=0.486);空白组和L-Arg组MMP-2表达量与L-NAME组相比差异无统计学意义[(t=1.602,P=0.17),(t=1.148,P=0.303)]。研究结论腹腔注射外源性L-Arg能够提高大鼠背部跨区皮瓣内Choke区NO浓度;NO能够促进大鼠背部跨区皮瓣术后ChokeII区血管增生和扩张,且这种促进作用可能与血管新生和局部炎症作用有关。