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背景
自身免疫甲状腺炎(auto immune thyroiditis,AIT)是最常见的自身免疫性甲状腺病,近年来发病率明显增加。AIT患者体内存在高滴度抗甲状腺过氧化物酶(TP0)和甲状腺球蛋白(Tg)抗体,甲状腺内有明显淋巴细胞浸润,可导致甲状腺功能减退。既往研究认为AIT可能是由于中枢免疫耐受被破坏、天然调节性T细胞(Regulatory T lynmphocytes,Treg)发育和功能缺陷及树突状细胞(DCs)和甲状腺滤泡上皮细胞(thyroid epithelial cells,TECs)异常的抗原递呈作用,导致甲状腺特异辅助性T细胞1(Helper T cell1,Th1)持续活化、增殖所致。目前认为AIT可能并非仅由经典Th1/Th2免疫反应所致,有其他免疫反应[如分泌白细胞介素17的辅助性T细胞(Interleukin-17secreting helper T cells,Th17)]存在。然而AIT的发病机制复杂,尚未完全阐明。AIT的临床特点及一些初步研究提示雌激素在AIT发病有重要影响:女性发病率为男性的3-4倍,高发年龄在30-50岁;该病常在妊娠时自发缓解而于分娩后恶化,且青春期发育是促进具有遗传背景的女性发病的重要因素。近年来发现雌激素受体(estrogen receptor,ER)有ERα和ERβ2种亚型,其各自介导的对靶器官的影响目前在国际上倍受关注,已发现有些情况下二者活化后产生的效应类似“阴阳”平衡。目前最常用的ERα选择性激动剂是化合物propyl-pyrazole-triol(PPT),β亚型选择性激动剂为diarylpropionitrile(DPN)。亚型选择性ER激动剂现为国外多家药物研究机构研发重点,可能给雌激素敏感性疾病提供新的防治手段。关于雌激素对AIT发病有何影响仍不清楚,缺乏直接干预一效应研究,而二种ER亚型各自被激活后所介导的对该病的作用更是未见报道。
目的
以Tg免疫易感株小鼠建立的EAT模型为研究对象,利用亚型选择性ER激动剂,直接探讨ERα和ERβ被各自单独活化对AIT发病的影响,并主要从免疫耐受、抗原递呈和Th极化与应答角度,探讨了ER活化介导的调节作用机制。
方法
4周龄CBA/J雌性小鼠在中国医科大学实验动物中心无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)级环境下饲养。6周龄时进行双侧卵巢切除(OVX),之后按美国Harlan Teklad公司提供的配方(Rodent Diet2016)生产的不含植物雌激素的饲料喂养,随机分为5组。分组如下:
OVX对照组:OVX+DMSO/玉米油,皮下注射,每4天1次直至动物被处死。
PPT1组:OVX+PPT(2.0mg/kg体重)皮下注射同上。
PPT2组:OVX+PPT(20.0mg/kg体重)皮下注射同上。
DPN1组:OVX+DPN(1.2mg/kg体重)皮下注射同上。
DPN2组:OVX+DPN(12.0mg/kg体重)皮下注射同上。
于9周龄时给予mTg(200μg/只)加完全弗氏佐剂进行初次免疫,11周龄时重复免疫一次(mTg加不完全弗氏佐剂),15周龄时处死动物。
取甲状腺组织做石蜡切片HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分;留取血清利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定Tg抗体(TgAb)滴度,包括Tg特异性总IgG和各IgG亚类;化学发光法检测小鼠总甲状腺素(Total thyroxine,TT4)及促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH);取脾制成单个核细胞悬液,免疫荧光染色、流式细胞学检测Tregs、Th17及DCs抗原递呈细胞比例的变化;提取小鼠脾细胞总RNA,实时定量逆转录聚合酶链反应法(Quantitative Real-Time Reverse Transcripte Polymerase Chain Reaction,real-timeRT-PCR)检测细胞因子:γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ,Th1型细胞因子)、白细胞介素-4(Interleukin-17,IL-4,Th2型因子)、白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17,Th17型因子)、白细胞介素-21(Interleukin-21,IL-21,Th17型因子)、转化生长因子-β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β,抑制性细胞因子)以及Th1、Th2、Th17及Tregs特异性转录因子:叉头蛋白P3(forkheadboxP3,Foxp3)、T-盒21转录因子(T-box21transcriptionfactor,T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA binding protein3,GATA3)、视黄酸受体相关孤儿受体γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleic acid,mRNA)的表达水平。应用SPSS16.0软件处理和分析数据。
结果
1、给予ERβ选择性激动剂DPN可导致EAT发病率、甲状腺炎症细胞浸润程度加重。而给予ERα选择性激动剂PPT后EAT发病率、甲状腺炎症评分与OVX对照组无明显差异。
2、给予ERβ选择性激动剂注射的DPN1组血清Tg特异性IgG1、IgG2b滴度较OVX对照组有升高趋势,DPN2组血清Tg特异性IgG1、IgG2a、IgG2b滴度显著升高,IgG3也有升高趋势。给予ERQ选择性激动剂注射的PPT组血清TgAb(IgG各亚类)滴度与OVX对照组比较无明显差异。
3、与OVX对照组比较,PPT组的血清TSH无明显改变,DPN组的血清TSH有升高的趋势(DPN1:P=0.095,DPN2:P=0.092)。血清TT4各组间无明显变化。
4、与OVX对照组相比,DPN1组小鼠脾细胞DC(CD11c+细胞)表面表达协同刺激因子CD86者(CD11c+CD86+)明显升高,DPN2组表达CD80(CD11c+CD80+)、CD86(CD11c+CD86+)者明显升高。PPT1组和PPT2组小鼠脾细胞DC中CD80、CD86表达比例无显著变化。DC中产生细胞因子IL-6、IL-12者均无明显差异。
5、除DPN2组小鼠脾细胞中T-betmRNA表达量高于OVX对照组外,各组IFN-γ、IL-4、GATA3mRNA表达量与OVX对照组相比无明显变化。
6、DPN组的小鼠脾细胞中RORγt、IL-17A、IL-21mRNA表达量增多,Th17细胞比例升高,以DPN2组最为显著。PPT2组小鼠脾脏CD4+T细胞中Treg(CD4+CD25+FOXP3+细胞)比例及Foxp3、TGF-βmRNA表达水平明显增多,DPN组未见减少,但各组Treg表面功能抑制分子GITR的表达水平均有上升,以PPT2组和DPN2组最为明显。
结论
1、ERβ可能是介导雌激素影响EAT发生发展的主要亚型,其单独活化可促进EAT的发生及加重其病情。
2、ERβ活化可能通过引起Th17/Treg功能失衡而促进EAT发生、发展。