多种哺乳动物精液保存的研究已达到较高水平并得到广泛推广,驴精液保存技术还不够成熟处于试验阶段,实际生产繁殖仍采用本交或按比例稀释鲜精后进行人工输精的方式。本研究试图采用氧化石墨烯(graphene oxide GO)作为精液保护物质进行驴的精液保存,以便探索驴精液保存的方法。GO是石墨烯经过氧化之后的产物,具有两亲性。根据GO特有的碳骨架结构,发现GO不但能有效地抑制重结晶和冰晶生长,并且能够修饰冰晶的形貌,在GO间冰晶形成曲面,通过Gibbs-Thompson效应抑制冰晶生长。本研究采用基础液(Tris30.4 g/L、柠檬酸17.0 g/L、葡萄糖15.0 g/L、果糖15.0 g/L、青霉素0.6 g/L、链霉素1.0 g/L)+15%卵黄作为稀释液,通过低温保存测定相对最适的氧化石墨烯添加量,后续进行不同预处理效果比较、不同冷冻程序效果比较、液氮蒸汽熏蒸法熏蒸高度和熏蒸时间比较以及不同解冻方法的效果比较,希望得到一个经济、简便、有效的冷冻方法。结果表明:基础液+15%卵黄+10%氧化石墨烯所得精子活率、质膜完整率、顶体完整率均极显著高于其他各组(p<0.01),畸形率极显著低于其他组(p<0.01)。冷冻保存前,两种预处理方法:直接离心和稀释五倍离心后进行冷冻,解冻后精子活率、畸形率、质膜完整率、顶体完整率均无显著差异(p>0.05),但比较精子质量指数发现直接离心法(0.52)优于稀释五倍离心法(0.50);程序冷冻法冻融后P1组精子活率极显著高于其他两组(p<0.01),其他指标均无显著差异(p>0.05);当采用蒸汽熏蒸法冷冻时,分别测得距液氮面高度4cm时精子活率极显著高于另外两组(p<0.01),距液氮面4cm熏蒸10min后精子活率极显著高于另外两组(p<0.01);比较37℃30s解冻和60℃6s解冻两种方法,60℃6s解冻法精子解冻后活率极显著高于37℃30s解冻法(p<0.01),其他指标均无显著差异(p>0.05);通过qRT-PCR检测RPL31、PLP1和PAPSS2三个基因在鲜精和冻融精液中的表达量,冻精和鲜精相比RPL31和PLP1基因极显著下调(p<0.01),PAPSS2基因极显著上调(p<0.01)。为解释冷冻保存过程中精子冷冻损伤的机制提供了一些可能性参考。