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谷氨酰胺(Glutamine,Gln)因其具有独特而复杂的生理功能,已成为营养学、生理学、营养免疫学等学科领域的研究热点,特别在维持肠道健康状态或修复病理肠道结构中具有重要作用。目前瘤胃pH过低造成瘤胃上皮细胞(Ruminal Epithelium Cell,REC)受到一定损伤的问题依然存在,Gln是否对酸损伤的REC有修复作用仍未可知。因此,本试验以Gln对体外培养的损伤REC的影响为研究主题,初步探索Gln在瘤胃上皮生长及损伤修复中的作用机理。实验一:REC原代分离和培养首先用9种不同种类和剂量的抗生素洗涤液冲洗瘤胃上皮组织;然后采用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在不同条件下对瘤胃上皮进行连续消化和分步消化以及先用0.1%胶原酶I消化再用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在37℃分步消化。结果表明:瘤胃上皮分别经过6倍青链霉素和6倍庆大霉素洗涤液的清洗后能有效去除瘤胃上皮表面微生物,瘤胃上皮先经过0.1%胶原酶I消化30min再经0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA分步消化后可获得较多的且活性较高的上皮细胞。实验二:细胞纯化与鉴定分别使用细胞刮除法,差速贴壁法,相差消化法三种不同方法进行细胞纯化,绘制相应的细胞生长曲线,使用HE染色方法和流式细胞技术分别从形态学和免疫学进行细胞鉴定。结果显示:使用差速贴壁法纯化后REC纯度在95%以上,呈典型的铺路石状,生长曲线呈“S”型,活性较好,可用于后续试验。实验三:REC损伤模型的建立根据牛发生亚急性瘤胃酸中毒(Subacute Rumen Acidosis,SARA)时,瘤胃液pH及瘤胃液中各种挥发酸比例,设置四组试验:第一组为对照组:pH 7.2正常培养基;第二组为用乳酸调整培养基pH 5.5组;第三组为用挥发酸100倍原液调整培养基pH 5.5组;第四组为用挥发酸+乳酸100倍原液调整培养基pH 5.5组。然后分别培养3、5、8、12、24 h,观察每个时间点细胞生长及凋亡状况。然后分别测定上清液中LDH、MDA、SOD、NO水平,以及细胞肿瘤坏死因子(TNF-α),炎症因子(IL-1、IL-8),细胞间连接蛋白(Claudin-1、occludin),细胞表面受体(TLR-2、TLR-4)等基因mRNA水平变化。结果显示:酸处理后12h时,细胞内开始出现空泡,细胞间隙变大,随后逐渐有细胞收缩,变形,漂起,呈明显的凋亡现象。在3h时上清液中LDH水平显著升高(P<0.05),SOD水平显著下降(P<0.05),细胞TNF-α,L-1β、IL-8基因mRNA相对表达量显著升高(P>0.05),occludin的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),3h时细胞表面受体(TLR-2,TLR-4)基因mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),而随着酸处理时间的增加,细胞表面受体mRNA相对表达量水平逐渐下降。说明:酸处理3h时,细胞已受到了损伤。所以使用挥发酸和乳酸共同处理细胞3h时即能产生较明显损伤效果,能成功建立损伤模型。实验四:Gln对损伤模型的修复用挥发酸+乳酸100倍原液调整培养基使pH 5.5,培养3 h后,换含有不同浓度Gln的培养基(Gln浓度分别为4、8、12、32 m M/L)进行修复培养。培养12 h后,收集细胞上清液和细胞。同样检测上清液成分及细胞相应肿瘤坏死因子、细胞表面受体、炎症因子、细胞间连接蛋白等mRNA水平。结果显示:低浓度的Gln细胞上清液中LDH水平较高;高浓度的Gln组其水平较低,TNF-α、IL-1β、IL-8、TLR-2、TLR-4基因mRNA水平较对照组均有所降低,occludin基因mRNA水平显著升高(P<0.05)。结论:Gln能通过促进细胞抗氧化酶的产生来增强细胞的抗氧化能力,促进上皮细胞间连接蛋白的表达,抑制炎性通路中促炎症因子的表达,从而对损伤3h的REC具有一定的修复作用。