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大豆(Glycine max)是世界上最重要的豆科作物,是油和蛋白质的主要来源。慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)中的B. japonicum、 B. elkanii等能与大豆有效共生固氮,从而减低作物生产过程中对氮肥的需求。由于Bradyrhizobium群体代表了非常有用的遗传资源,加上大豆的经济价值,这让Bradyrhizobium属成为了研究的热点。加拿大的特殊地理位置,使它成为种植大豆的最北部地区,大豆产量居世界第七位。尽管大豆生产对加拿大的农业和经济有着非常重要的影响,但却没有关于大豆共生根瘤菌基因资源方面的信息,特别是缺乏代表性共生根瘤菌Bradyrhizobium种群多样性、动态学、群体结构或进化史方面的资料。研究Bradyrhizobium属的生物多样性,不仅有利于为可持续的农业生产开发新的根瘤菌资源,发掘新的根瘤菌基因资源,还可以进一步清楚地展示Bradyrhizobium属内的分类地位,揭示属内的遗传进化关系,同时还可以为大豆生产筛选高效的根瘤菌菌株。本研究对从加拿大东部两个采样地(相距280公里,有显著不同大豆种植史和接种史)分离的Bradyrhizobium群体进行了系统的调查研究,结果如下：1.通过植物诱捕,收集了220株共生细菌。同时,还收集了已知的在加拿大用于大豆接种的Bradyrhizobium接种菌。所有分离株具有共同的特点：在YEM培养基上生长缓慢：28℃培养7-14天后,菌落直径小于1mm：都能在大豆上结瘤。2.成功扩增了所有供试菌株的6个看家基因,并进行了序列测定,获得了长度为435bp (atpD),555bp (glnll)、462bp (recA)、618bp (gyrB)、771bp (rpoB)和369bp (dnaK)的基因片段。各看家基因拥有的等位基因数从9(dnaK)到17(rpoB)变化,而单个基因座的遗传多样性(π)从00251(atpD)到0.0338(recA)变化。所有基因座的dN/dS平均值均小于1,表明这些基因座正处于稳定或净化选择。另外,phi test检验显示,gyrB和recA基因座存在显著的重组,而其他基因座没有检测到显著的重组。3.220株分离株6个看家基因的合并序列组成了35个独特的多位点序列类型(ST)。其中,15个ST的分离株来源于采样地A,27个ST的分离株来源于采样地B,7个ST的分离株来源于A、B两地。其中,ST21含有最多的细菌,共有53株分离株,占所有分离株的24.1%,其次是ST15,共有36株分离株,占所有分离株的16.4%。4.参比接种菌中,USDA136和USDA122拥有相同的ST,归入到ST4。而532C、USDA138和B. japonicum USDA6T也拥有同样的ST,归入到ST24。只有很少一部分分离株被鉴定为推定接种菌。其中,采样地A只获得了一株推定接种菌；采样地B中31%的分离株被鉴定为推定接种菌。采样地A、B均未获得与接种菌61A124相关的分离株。5.多位点序列分析及微进化分析结果表明,与大豆共生的Bradyrhizobium群体高度结构化,并呈现出遗传多样性。所有的分析都支持将220株分离株分入5个系统分支,分别对应于是B.japonicum group1、 B.japonicum group1a以及Bradyrhizobium属内3个新的系统分支。6. STRUCTURE分析显示,220株分离株起源于5个Ancestral Lineage。 Lineage I中的分离株全部来自采样地B,而Lineage III中的菌株全部来自采样地A,并且这两个Lineage中菌株的遗传物质都是100%来自各自的Ancestral Lineage,这为分离株的空间分布提供了有力的证据。20株分离株(分别来自Lineage Ⅱ、 Ⅳ、Ⅴ)呈现山不同程度的混合祖先,这表明Lineage (?)发生了基因漂流,但不频繁。被鉴定为推定接种菌的这些ST中,只有有ST24(532C)展现出了混合祖先,遗传物质分别来自Ancestral Lineage Ⅱ、Ⅲ、ⅠV和V,并且ST24是唯一一个来自采样地B且继承有Ancestral LineageIII遗传物质的ST。7.一致网络图显示,220株分离株被分入了5个清晰地类群,这和STRUCTURE推断的5个Lineage完全一致。对应于LineageⅠ、Ⅱ和Ⅲ的3个类群中没有任何标准菌株,位于独立的系统分支上,表明它们是Bradyrhizobium属内新的演化谱系。 LineageⅣ和Ⅴ中观察到了中度复杂的网状结构,它们的存在及复杂程度反映了系统发育不确定性的程度,同时也暗示了重组的存在。8. ClonalFrame分析发现,重组对系统发育的推断有显著影响。共鉴定了21个重组事件,其中,12个重组事件发生在gyrB基因座上。代表内部节点的祖先推断中,没有一个推定接种菌被鉴定为外部节点的最近祖先。所有Lineages的重组与突变比值的比率(p／0)是0.05,这表明发生重组的频率是发生突变的频率的二十分之一；重组相对于突变的作用(r／m)的值是0.59,说明突变大约2倍于重组引起核苷酸替换。 LineageⅡ的外部分支与内部分支长度比率高于预期值,说明该lineage最近经历了一次群体扩大。9. Unifrac分析显示,Lineage间分离株频率的差异存在于采样地间(P<=0.01)和栽培种间(P<=0.01)。代表Lineage的分离株和代表单个ST的分离株在采样地间及大豆栽培种间的频率也有显著差异。这些都为群体的空间结构提供了证据。10.共生基因nodC序列由7个等位基因类型组成,遗传多样性(π)为0.0167,GC含量为57.3%；dN/dS平均值为0.076,说明该基因正处于稳定或净化选择;phi检验没有检测到显著的重组。一致网络图中nodC序列分入了2个明显区分的群：nod I和nod II,并且几乎没有明显的网状结构,说明nodC基因座的重组很少见。Chi-square检验结果显示,nod I中分离株的频率在采样地间存在显著差异,而nod II中分离株的频率在采样地间不显著。nod I和nod II中分离株的频率在栽培种间都没有显著差异。11.供试菌株间的固氮有效性存在相当大的差异。一些推定接种菌的固氮效率很低,这说明这些分离株正经历固氮基因的遗传变化或它们本来就存在于土壤中,只是碰巧与接种菌拥有同样的多位点基因型(ST)。