粘细菌是一类具有复杂多细胞社会学行为的革兰氏阴性杆菌。粘细菌有一系列明显的特征：能够滑动运动；具有以可以形成子实体和粘孢子为标志的复杂的生活史：强大的降解非水溶性大分子的能力；能够产生种类繁多的生物活性代谢产物。这些特征都是其适应生态竞争环境的有力手段。在营养物质大分子丰富时,粘细菌以滑动运动的方式,不同细胞之间的群体协作性地聚集在一起,同时向胞外分泌大量水解酶类协同降解营养物质,这种行为为粘细菌营养捕食提供了高效的方式。当周围环境中营养物质的消耗而停止生长时,细胞发生聚集,此时多数细胞发生程序性死亡,而保存下来的粘孢子具有很强的抗逆性,是典型的休眠结构。高度适应环境的粘细菌分布广泛,尤其是在有机质丰富的环境中。土壤、粪便、腐殖质以及树皮等组织是粘细菌典型的自然生境。粘细菌可以形成种类丰富、功能多样的生物学活性物质。根据目前对粘细菌的代谢产物报道,已经发现了超过100种基本化学结构及500余种基本结构的衍生物,占微生物来源的3.5%。纤维堆囊菌属能高效地利用自然界里丰富的纤维素资源,是粘细菌中能够降解纤维素的生理类群,尤其令人感兴趣的是该属菌株能够产生丰富的次级代谢产物。菌株次级代谢物产生率接近100%,而且在粘细菌共17个属所产生的次级代谢产物种类中,堆囊菌属的次级代谢产物可达到48.4%。菌株So0157-2是本实验室从盐水湖岸边土样品中分离鉴定的一株纤维堆囊菌。实验室前期生物学活性分析结果证实So0157-2可以产生包括埃博霉素(epothilones)在内的多种生物活性物质。So0157-2生长速度快、埃博霉素产量相对较高,尤其是进行了菌株选育并优化了大规模液体发酵条件后,epothilones产量得到一定幅度的提高,使得其成为一株具有工业应用前景的埃博霉素产生菌。但是无论是在So0157-2中还是在国际上其他实验室的发酵生产菌株,埃博霉素的实际生产量相对于发酵培养体系、底物利用率以及生物量都存在着转化效率低的问题,仍然有很大的提升空间。如何能够充分利用营养底物,将碳源、氮源转化为埃博霉素,是研究者最为感兴趣的问题。因此对纤维堆囊菌基础生理代谢特性的研究、改造埃博霉素的底物利用效率,对纤维堆囊菌资源开发与利用具有巨大的理论意义和经济价值。本论文从纤维堆囊菌一个典型的生理现象：胞内产生并积累大量的内含物作为突破口,研究纤维堆囊菌碳源贮存与利用、调节胞内代谢流,阐述了碳源的积累与消耗对于次级代谢产物埃博霉素的关系。并尝试对内含物积累与消耗有着重要调控作用的酶进行研究,以期在阐明机理的同时获得高效利用碳源的突变菌株。首先,本文对纤维堆囊菌产生胞内内含物做了系统的研究和描述。通过培养观察,统计实验室分离保存的近20株纤维堆囊菌发现,产生内含物在纤维堆囊菌中是一个普遍的现象。同时在不同培养基、不同培养条件下,内含物的量与营养的丰富程度存在正相关性。通过建立一套适合纤维堆囊菌内含物形态分析定量的方法,描述了内含物的形态发生规律和单批培养中内含物在量上的变化规律；摸索建立了适合纤维堆囊菌液体培养生物量检测的方法,通过对生物量时间曲线的绘制,揭示了细胞生长存活与内含物产生与消失的关联。实验结果表明内含物对于维持细胞生存有着直接的关系。其次,对纤维堆囊菌产生的胞内内含物的主要组成成分做了系统分析和鉴定。建立了适合纤维堆囊菌内含物分析和检测的方法。通过苏丹黑将细胞内含物染色,从而将内含物的性质归类为脂性内含物。通过薄层色谱(TLC)对细胞总脂进行展示和分析,表明在细胞总脂中,三酰基甘油类占了很大的比重。然后采用密度梯度离心分离、纯化内含物,采用气相色谱质谱法(GC/MS)结合串联四级杆质谱法(ESI/MS/MS)的综合分析,获得了内含物主要组分的分析鉴定结果。结果表明在内含物中的三酰基甘油具有着很大的多样性,脂肪酸形式多样,在碳原子数目上存在着13到18个碳原子不等的脂肪酸,同时在链上存在单不饱和键和共轭双键；在链的形式上存在直链的和末端带有支链(异酰基,iso)的多种形式,同时这些脂肪酸在形成三酰基甘油时其组合形式也具有多样性。但是主要的成分是饱和脂肪酸组成的三酰基甘油,而其中主要的成分是以脂肪酸组成为i16：0/i16：0/i16：0形式的三酰基甘油。再次,我们对纤维堆囊菌产生胞内内含物与碳源贮存和能量供应的关系做了系统研究和分析。通过采用不同种类的碳源进行培养发现,内含物在碳源丰富的环境中积累水平最高；同时在营养物质缺失的HEPES缓冲液中孵育培养,这种饥饿处理的方式可以加速内含物消耗。这两方面的实验表明,胞内存在着碳源代谢的动态平衡过程,内含物作为胞内贮存的碳源在营养贫瘠的条件下被调动利用,供细胞生长与代谢所需,内含物的积累是纤维堆囊菌适应环境、应对逆境的一种有效手段。为进一步调控内含物的积累与消耗,我们将脂肪酸合成相关酶的抑制剂,异烟肼、三氯生和芝麻酚,分别添加到培养体系中。抑制剂可以调控内含物的积累与消耗,表现为内含物的加速消耗；同时,抑制剂的这种效果可以通过补加碳源得以恢复或者抵消。实验结果揭示了胞内存在着碳源代谢流的动态平衡过程。同时我们发现,抑制剂也改变了埃博霉素的产量和组成的情况。在异烟肼浓度为10 mg/L、发酵21天时,与同批次补水对照组相比,埃博霉素产量最高可达到2.88倍；在发酵初始阶段添加终浓度为0.1μg/L脂肪酸合成酶抑制剂三氯生、发酵14天时,埃博霉素产量提高到1.77倍,在发酵初始阶段添加终浓度为0.1μg/L苹果酸酶抑制剂芝麻酚、发酵14天时,可提高到1.69倍。而培养中期补加高浓度异烟肼(终浓度1g/L),虽然埃博霉素的产生总量没有提高,但是却明显改变了埃博霉素A与B的组成比例,A/B的比值可提高到4.1/1左右,而正常值为1.3-1.4/1左右。二碳单位碳源乙酸钠与三碳单位碳源丙酸钠的添加也能够在埃博霉素的产量和组成上产生同样的效果。补加乙酸钠能够将埃博霉素总量提高到对照组的1.2-1.6倍,埃博霉素A/B的比值接近2.2/1；补加丙酸钠时埃博霉素总量提高到1.5倍,并使埃博霉素B的产量超过A,A/B的比值为1/1.4。这一系列结果说明,在环境中营养基本耗尽的培养中后期,贮存在内含物中组分的降解提供了大量的二碳单位,为埃博霉素等次级代谢物的产生提供了必要的前体与能量。最后,我们通过在大肠杆菌中异源表达三酰基甘油合成与降解的关键酶：二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)、三酰基甘油酯酶(TAGL)、单脂酰甘油水解酶(MAGL),在分子水平上对内含物成分的合成与降解代谢进行了研究和分析。用了5种表达质粒载体,共构建了11个重组载体,其中pET 15b-tagl, pET22b-tagl, pET28a-tagl, pET30a-tagl, pGEX-6p-1-tagl是用于在大肠杆菌中异源表达TAGL酶的,pET15b-dgat, pET22b-dgat, pET28a-dgat, pET30a-dgat, pGEX-6p-l-dgat是用于在大肠杆菌中异源表达DGAT酶的；pET22b-magl是用于在大肠杆菌中异源表达表达MAGL酶的。MAGL酶得到了可溶性的表达,DGAT与TAGL在尝试了更换表达载体仍然无法得到可溶蛋白之后,选择利用蛋白在尿素中变性再复性重折叠的方式,成功摸索建立了实验技术流程,并获得了TAGL的活性酶蛋白。随后对TAGL与MAGL酶活做了初步分析,得到其酶活反应动力曲线,确定了反应最适温度为30℃。在上述异源表达的基础上,我们通过接合转移体系对纤维堆囊菌So0157-2的菌体内含物主要成分酰基甘油的关键合成与降解基因三酰基甘油酯酶(TAGL),以及二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因编码序列进行敲除,构建了用于接合转移敲除的诱动接合转移载体pCC4T及pCC4D,目前已获得了-次同源重组的接合子,期望后续的实验能够获得完全的基因敲除突变株,在内含物积累消耗与埃博霉素产量上考察三酰基甘油合成与降解的阻断对菌体碳源积累与次级代谢的影响,同时获得较高底物利用效率的埃博霉素产生菌株。