论文部分内容阅读
目的:通过肝癌HepG2细胞的体外三维培养,观察其形成血管生成拟态的能力,探讨重组人Canstatin基因表达产物对肝癌HepG2细胞血管生成拟态形成能力的影响及作用机制。方法：将pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒,用Cacl2法转染到大肠杆菌DH5a,经AMP筛选,挑取阳性质粒酶切鉴定、测序,用脂质载体介导法将pcDNA3.1-Canstatin"3Flag转染人肝癌HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1转染肝癌HepG2细胞为对照,经G418培养基筛选获得阳性克隆,Western-blot鉴定转染细胞中Canstatin蛋白的表达。建立HepG2细胞基底膜基质凝胶体外三维细胞培养模型,以HepG2细胞在六孔板中常规培养为对照,观察HepG2细胞血管生成拟态形成能力。各组细胞(HepG2细胞组、空载体转染HepG2细胞组、重组载体转染HepG2细胞组)分别在96孔板中常规培养48h,MTT法检测各组增殖抑制率。各组细胞在基底膜基质凝胶进行体外三维培养,观察比较各组细胞的血管生成拟态形成能力,同时用免疫细胞化学法检测各组细胞MMp-2、VE-cadherin蛋白表达情况。结果：成功获得684bp人Canstatin基因,测序证明与Genbank中比对一致。PCR可检测出重组载体转染人HepG2细胞基因组中存在Canstatin基因,Western-blot可检测出Canstatin基因在重组载体转染人HepG2细胞中有特异性表达。人肝癌HepG2细胞在体外三维培养72h,直接在倒置显微镜下观察,可见细胞呈长梭形,周边长出多个伪足,彼此之间形成网状连接,形成环状或管状结构(血管生成拟态VM),而人肝癌HepG2细胞在六孔板中常规培养下贴壁生长,未见VM结构。MTT法检测HepG2细胞组、空载体转染HepG2细胞组、重组载体转染HepG2细胞组490nm波长吸光度值并计算增殖抑制率分别为：0%、3.57%、14.80%。倒置显微镜下(x200)随机取上、下、左、右、中5个视野记录环状结构的数量,重组载体转染组VM结构的计数为(2.67±2.08)个,低于HepG2细胞组(9.67±3.51)个(P<0.01),与空质粒转染组(11.00±3.61)个对比有统计学意义(P<0.01),空质粒转染组与HepG2细胞组对比无统计学意义(P>0.01)。免疫细胞化学法检测各组细胞VE-cadherin蛋白表达灰度值为：重组载体转染组细胞(5.63±0.42),低于空载体转染组(14.58±0.72)(P<0.01),同时也低于HepG2细胞组(16.73±1.32)(P<0.01),空载体转染组和HepG2细胞组VE-cadherin蛋白表达灰度值无差异(P>0.01)。HepG2组、空载体转染HepG2组、重组载体转染HepG2组MMp-2蛋白表达灰度值分别为27.53±1.03、25.72±0.83、27.02±2.13,各组间P值无显著性差异(P>0.01)。结论：1.人肝癌HepG2细胞株在体外常规培养下未见VM结构,在体外三维培养条件下具有血管生成拟态的形成能力；2.成功将pcDNA3.1-Canstatin-3Flag分泌型重组质粒转染至人HepG2细胞中,细胞中有Canstatin蛋白表达；3Canstatin蛋白可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖；4Canstatin蛋白可抑制人肝癌HepG2细胞血管生成拟态的形成能力；5Canstatin蛋白可抑制体外三维培养条件下HepG2细胞VE-cadherin蛋白的表达,对MMp2的表达没有影响。