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研究背景miRNA是内源性的微小ncRNA,研究表明它参与多种生理和病理过程的调节,与人体健康以及各种疾病密切相关。自噬和凋亡是两种可能相互作用或拮抗的基本生物学机制,在哺乳动物的发育、细胞稳态和肿瘤发生过程中均发挥重要作用。在细胞中它们同时存在,并共享共同的上游信号和刺激,因此可以相互结合或相互排斥。miRNA可以通过调控自噬蛋白来调节自噬,同时也可以作为促凋亡和或抗凋亡蛋白的上游影响细胞凋亡。CircRNA与miRNA一样是ncRNA,但是CircRNA是一种较长的内源性ncRNA分子,它具有由共价键相连的闭合的连续环状结构。CircRNA可以通过与miRNA靶向结合继而对细胞调控网络和表观遗传学产生重要影响。然而,CircRNA与miR-664在UVB诱导的皮肤损伤中的作用至今尚未有深入的研究,本课题旨在探讨CircRNA与miR-664的相互关系以及它们对UVB诱导的皮肤损伤的影响,为UVB诱导的皮肤损伤提供临床治疗的理论基础。方法①UVB照射处理:用30mJ/cm2强度的UVB照射HaCaT细胞,细胞培养箱培养相应时间段后收集细胞进行相应检测。②瞬时转染:合成miR-664的小干扰RNA,构建SMAD4的过表达载体利用脂质体瞬时转染进HaCaT细胞,分别构建miR-664下调的或SMAD4上调的细胞模型。③瞬时转染合并UVB处理:脂质体转染24h进行UVB照射处理。④利用流式细胞仪分别检测miR-664下调的或SMAD4上调的HaCaT细胞的凋亡率和细胞周期分布。⑤利用qPCR技术检测处理后的HaCaT细胞中目的基因（miR-664、SMAD4和circFBXW8）的mRNA 水平。⑥利用 western blot 检测目的蛋白（SMAD4、LC3、BECN1、Bc12和GAPDH等）的表达情况。⑦利用生物信息网站预测miR-664的靶基因,circRNA与miR-664的靶向关系和对circRNA测序结果进行分析。⑧荧光酶素报告实验验证SMAD4是miR-664的靶基因。⑨利用收敛引物和发散引物扩增cDNA和gDNA,水平凝胶电泳和Sanger测序验证circFBXW8环性。⑩circRNA的cDNA文库的构建后,文库经Agilent 2100检测及qPCR定量后以Illumina测序仪进行测序。⑾构建circFBXW8的过表达载体,利用慢病毒感染细胞,建立circFBXW8过表达的HaCaT细胞稳定株,并用qPCR检测其过表达效率。⑿AG02-RIP验证circFBXW8与miR-664的靶向关系。结果①①UVB照射后HaCaT细胞中凋亡增加,自噬增加,S期阻滞,miR-664、LC3表达上调,Bcl2表达下调。②经UVB照射后HaCaT细胞中的SMAD4表达降低,与miR-664呈负相关,荧光酶素报告实验证实SMAD4是miR-664的靶基因。③Illumina测序发现103条circRNA差异表达,其中15个与miR-664存在靶向关系。④qPCR证实在UVB照射后circFBXW8表现为表达下调与miR-664 呈负相关。⑤过表达 circFBXW8 后,LC3、BECN1、Bcl2 上调,Bax表达下调,细胞凋亡减少,说明可以抑制UVB诱导的HaCaT细胞的凋亡和自噬。⑥AGO2-RIP实验证实circFBXW8靶向调控miR-664调节SMAD4作用于HaCaT细胞的凋亡和自噬。结论CircFBXW8靶向miR-664作用于SMAD4调控UVB诱导的HaCaT细胞的凋亡和自噬。