药物成瘾是一种涉及到奖赏、学习记忆、动机、决策、执行和中枢控制等一系列高级神经精神功能异常,发病机制极为复杂,复发率极高的慢性脑病,是重大的医学生物学和社会问题。根据《2018年中国毒品形势报告》,全国现有吸毒人员240.4万名,甲基苯丙胺成瘾人员135万名,,占56.1%,甲基苯丙胺已经成为我国目前最主要的成瘾物质。与传统毒品相比,甲基苯丙胺具有极强的躯体依赖性和精神依赖性,严重损害中枢神经系统并造成不可逆损伤,不仅严重危害成瘾者自身健康,还引发了诸多社会、经济及公共卫生等问题。然而,甲基苯丙胺成瘾的神经生物学机制尚未阐明,目前仍未有有效的干预和治疗措施。现有的研究认为,治疗药物成瘾的关键在于解决复吸问题,而解决复吸问题的关键在于消除成瘾记忆的“顽固性”。药物成瘾记忆是在成瘾性药物的正性奖赏、戒断负性情绪及药物相关线索的综合影响下,形成的持久的、难以消退的病理性学习记忆,使得成瘾患者即使在经历数年、数十年的戒断之后,仍能被诱发对药物的强烈渴求和复吸。其中,药物相关线索诱发成瘾者对药物的渴求是临床上导致复吸的最重要因素之一。虽然大量研究表明,线索在成瘾的形成、维持和复吸中发挥的重要作用与其被赋予的条件性强化效应和奖赏效应相关,但背后的神经生物学机制并未阐明。联合学习记忆是一种重要的信息获取方式,其对于逻辑推理、联想思维、比较和计算都是必不可少的。两个或多个事件在时间和空间上有反复多次的相互作用时,它们之间能够相互关联,使机体明白个事件的出现意味着其它事件的出现,即建立联合学习记忆。联合学习分为巴甫洛夫条件反射和操作性条件反射两种类型。王晋辉研究员发现,建立触觉-嗅觉巴甫洛夫式的联合学习记忆后,触觉皮层神经元可以被嗅觉刺激激活,引起触觉信号引起的行为;反之亦然。这提示联合学习记忆对被关联的两个刺激具有双向的作用。此外,联合学习记忆的建立伴随触觉和嗅觉相关皮层之间神经投射的增加和突触结构、突触功能的变化,提示存储联合学习记忆的联合记忆细胞可能是联合学习记忆的物质基础。鉴于药物成瘾也是一种与离散线索、辨别线索、情境线索相关联的病理性学习记忆,联合学习记忆是否也有可能参与甲基苯丙胺成瘾及复吸呢?前人的大量研究采用巴甫洛夫向操作性条件反射转换(Pavlovian-to-Instrumental Transfer,PIT)模型,通过从操作行为中分离出线索与成瘾性药物的巴甫洛夫配对,揭示药物相关线索的内生动机(而非条件性强化效应)是其诱发复吸的原因。然而,在用药环境外开展的线索消退治疗虽然能够减少机体对药物相关线索的主观渴求和生理反应,却并不能减少复吸,提示药物相关线索诱发复吸的背后一定存在内生动机之外的其他机制。另一方面,小剂量药物诱发复吸被认为与机体的内感受相关,但其机制同样尚未阐明。那么,在甲基苯丙胺成瘾和线索诱发复吸中,是否也有可能存在联合学习记忆对关联刺激(甲基苯丙胺和相关线索)的双向作用呢?这种改变及其背后的神经生物学机制是否是甲基苯丙胺成瘾和复吸的重要原因呢?前人关于成瘾的研究仅关注了联合学习记忆对药物相关线索的影响,而一直忽略了联合学习记忆对药物自身效应的研究。我们的科学假说认为甲基苯丙胺成瘾记忆与感觉联合记忆相似,机体在线索和甲基苯丙胺奖赏效应之间建立快速、强烈的联合学习记忆,存储在成瘾联合学习记忆细胞中,使线索能够引起机体对甲基苯丙胺的反应,同时甲基苯丙胺的出现也能够引起类似线索信号的反应。在这一过程中,联合学习增强了甲基苯丙胺和线索相关脑区间原有的联系,形成了新的神经投射和新的突触连接,易化学习过程,促进甲基苯丙胺成瘾的形成和维持。同时,由于成瘾联合学习记忆细胞存储甲基苯丙胺和线索相关的记忆,所以甲基苯丙胺和线索都可以激活成瘾联合学习记忆细胞,从而诱发用药行为和觅药行为(复吸行为)。因此,不仅药物相关线索可以在没有甲基苯丙胺的情况下诱发机体对药物的渴求,从而引起复吸行为;而且药物自身引起的反应也会得到增强。要证明此假说的客观性,我们必须在行为学和神经生物学水平上找到证据。这对于阐明甲基苯丙胺成瘾和复吸的机制具有重要的理论意义,还可能为干预和治疗甲基苯丙胺成瘾及复吸提供新线索和新思路。实验方法1.在经典的小鼠自身给药模型上和改进的小鼠自身给药模型上研究伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对甲基苯丙胺+视觉线索、甲基苯丙胺自身诱发用药行为的影响。2.在改进的小鼠PIT模型上区分视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习和视觉线索的条件性强化效应,研究其对甲基苯丙胺自身诱发成瘾行为形成及环境消退的影响。3.进行Tet on条件性基因表达系统验证,为在药物作用的初级脑区腹侧被盖区(Ventral Tegmental Area,VTA)和视觉刺激的初级脑区视觉纹状皮层V1区(striatum cortex V1,SCV1)标记成瘾联合学习记忆细胞,揭示甲基苯丙胺成瘾的联合学习记忆机制打下基础。研究结果1.伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对成瘾行为的影响(1)形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆增强甲基苯丙胺诱发的自身给药行为的形成,增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药行为在经典的自身给药模型固定比率1(fixed ratio,FR1,触1次有效鼻触获得1次药物注射)程序下,在为期11天的训练阶段(形成期,3小时/天,注射次数上限为100次),小鼠随机分为配对线索刺激组(Paired Stimulus Group,PS组,1次甲基苯丙胺注射伴随5 s鼻触灯)、不配对线索刺激组(Unpaired Stimulus Group,UPS组,随机出现的5 s鼻触灯与甲基苯丙胺注射不关联)和对照组(Control Group,Con组,鼻触灯不亮)。结果显示,与UPS组和Con相比,PS组甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/次)注射次数显著增加(具有一个重复测量的双因素方差分析:线索配对主效应P<0.01,时间主效应P<0.001,交互作用P<0.001,n=6)。第12天进行药物单一刺激测试,3组小鼠1次有效鼻触均只能获得1次甲基苯丙胺(0.05mg/kg/次)注射,无视觉线索(鼻触灯不亮)。实验结果显示,与UPS组和C on组相比,PS组甲基苯丙胺注射次数显著增加(单因素方差分析:线索配对主效应P<0.05,n=6)。以上结果提示,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆增强甲基苯丙胺诱发的自身给药行为的形成,增强形成期甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药行为。然而,在该模型中,PS组甲基苯丙胺总摄入量也显著高于UPS组和Con组(单因素方差分析:线索配对主效应P<0.05,n=6),存在甲基苯丙胺摄药量不均衡的问题,导致3组间药物正性强化作用存在差异。因此,无法区分该模型中药物自身效应的增强足联合学习记忆的直接作用还是联合学习记忆通过增强操作行为,增加PS组甲基苯丙胺摄入量和奖赏效应而产生的间接作用。(2)在摄药量相同的情况下,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆直接增强形成期用药动机,对于药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用为了研究联合学习记忆能否直接对甲基苯丙胺自身给药行为形成以及甲基苯丙胺自身作用产生影响,必须首先排除各组摄药量不均衡引起的药物正性强化作用的差异。因此,我们对传统自身给药模型的训练模式进行了调整。改进后的自身给药模型(训练模式2)采用FR1训练程序,小鼠依旧分为PS组(1次甲基苯丙胺注射伴随5 s鼻触灯)、UPS组(随机出现的5s鼻触灯与甲基苯丙胺注射不关联)和Con组(鼻触灯不亮),测量各组小鼠每天获得30次甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/次)注射所需时间,以此评价3组小鼠用药动机的强弱。在为期12天的自身给药形成阶段,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠获得30次甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/次)注射所需时间显著降低(具有一个重复测量的双因素方差分析:线索配对主效应P<0.001,时间主效应P>0.05,交互作用P>0.05,n=8～9)。在第13天进行药物单一刺激测试,3组小鼠1次有效鼻触均只能获得1次甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/次)注射,无视觉线索(鼻触灯不亮)。实验结果显示,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠获得30次甲基苯丙胺注射所需时间显著降低(单因素方差分析:线索配对主效应P<0.001,n=8～9)。第14天对PS组和UPS组进行线索单一刺激测试,小鼠1次有效鼻触均只能获得1次视觉线索(5 s鼻触灯),无甲基苯丙胺注射。实验结果显示,与UPS组相比,PS组小鼠获得30次视觉线索所需时间显著降低(t检验,P<0.01,n=9)。以上结果提示,形成期伴随操作行为的视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆直接增强甲基苯丙胺+视觉线索、甲基苯丙胺自身诱发的用药动机,增强线索自身诱发的觅药动机。因此,联合学习记忆不仅直接增强用药动机,而且对药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用。2.视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习对成瘾行为的影响前人的大量研究认为药物相关线索的条件性强化效应和内生动机是线索增强成瘾行为形成以及消退后诱发复吸的原因。然而,我们的研究发现建立了视觉线索(鼻触灯)与甲基苯丙胺的联合学习记忆后,即便没有线索出现时,甲基苯丙胺自身诱发的用药行为也得到了增强,这提示线索增强成瘾形成可能还存在其他的作用机制。为了进一步研究是药物与线索巴甫洛夫联合的直接作用,还是线索条件性强化效应的间接作用,造成了形成期甲基苯丙胺自身效应的增强,我们采用改进的PIT模型分离巴甫洛夫训练和操作性行为训练。(1)视觉线索和甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习直接增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药动机,促进甲基苯丙胺成瘾行为的形成在改进的PIT模型中,首先进行为期8天的FR1训练(3小时/天,注射次数上限为100次,无视觉线索,即鼻触灯不亮),建立小鼠甲基苯丙胺(0.05mg/kg/次)自身给药行为。第9天进行前测,1次有效鼻触获得1次甲基苯丙胺注射,无视觉线索(鼻触灯不亮),将每只小鼠在第6-8天的平均甲基苯丙胺注射次数设置为各自的任务量,测量每只小鼠完成各自的任务量所需时间。前测后,综合考虑每只小鼠的任务量、前测时间、1-9天甲基苯丙胺总摄入量将小鼠均衡分为配对线索刺激组(PS组)、不配对线索刺激组(UPS组)和对照组(Con组)。在第10天和14天分别进行视觉线索(鼻触灯)与甲基苯丙胺的巴甫洛夫配对,3小时/天。在巴甫洛夫配对阶段,小鼠获得甲基苯丙胺(0.05 mg/kg/次)被动注射,且每只小鼠获得的注射次数与其在前测时的任务量相等,以此保证每只动物获得的奖赏强度不变。PS组每次甲基苯丙胺被动注射伴随5s鼻触灯;UPS组甲基苯丙胺被动注射与随机出现的5 s鼻触灯不关联;Con组只获得甲基苯丙胺被动注射,鼻触灯不亮。在第11-13天及第15-16天进行后测,即无视觉线索(鼻触灯不亮)出现的甲基苯丙胺单一刺激测试,方法与第9天前测完全相同。结果显示,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠完成各自任务量所需时间显著降低(双因素方差分析:线索配对主效应P<0.001,时间主效应P>0.05,交互作用P>0.05,n=4),提力视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习直接增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药动机,促进甲基苯丙胺成瘾行为的形成。以上结果说明,线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习不仅是线索的条件性强化和内生动机的基础,而且对甲基苯丙胺成瘾的形成具有直接的增强作用;这是甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆机制存在的行为学证据。(2)视觉线索和甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习减慢甲基苯丙胺成瘾的环境消退过程为了研究视觉线索与甲基苯丙胺的联合学习记忆对消退复吸的影响,我们从第17天开始对3组小鼠进行14天的环境消退,3小时/天,触有效鼻触和无效鼻触均只记录,无甲基苯丙胺注射和视觉线索(鼻触灯不亮)。结果显示,与UPS组和Con组相比,PS组小鼠有效鼻触数显著升高(双因素方差分析:线索配对主效应P<0.05,时间主效应P<0.001,交互作用P>0.05,n=4),提示形成期视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习减慢甲基苯胺成瘾的环境消退过程。以上结果说明形成期视觉线索与甲基苯丙胺的巴甫洛夫联合学习使成瘾行为更难消退,这可能与在PS组建立视觉线索-甲基苯丙胺巴甫洛夫联合学习的过程中甲基苯丙胺和视觉线索自身的效应都得到了增强,且二者与环境线索都建立了更强的联合学习记忆,从而使得环境线索在消退时激活更多的记忆细胞,诱发更强的觅药动机有关;这是甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆机制存在的第二重行为学证据。3.用于成瘾联合学习记忆细胞标记的Tet on条件性基因表达系统验证通过前两章的研究,从行为学上明确了联合学习记忆参与了甲基苯丙胺成瘾行为的形成,是成瘾行为难以消退的原因。为了阐明联合学习记忆参与甲基苯丙胺成瘾的神经生物学机制,我们需要找到成瘾联合学习记忆机制的物质基础,即甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞。我们将采用训练模式2,在甲基苯丙胺单一刺激测试中采用Tet on条件性基因表达系统标记仅被甲基苯丙胺激活的神经细胞(称为一相标记),在视觉线索单一刺激测试通过Fos免疫荧光染色标记仅被视觉线索激活的神经细胞(称为二相标记)。当一个神经细胞同时被Tet on系统和Fos标记上时,我们就初步判断其为存储了甲基苯丙胺和视觉线索相关记忆的成瘾联合学习记忆细胞。Tet on系统属于四环素调控系统,其对细胞的时空特异性标记依赖于脑内Fos的表达及外源性给予强力霉素(doxycycline,Dox)。为了确定Teton系统在甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆细胞标记中的可行性及最适诱导时间,我们将Tet on病毒系统注射到小鼠VTA中,分别在甲基苯丙胺或盐水刺激取脑前6天、前3天和前1天三个时间点开始给予Dox,通过观察VTA中mCherry及Fos的表达情况,验证Teton系统。病毒表达2周后,对小鼠进行甲基苯丙胺(1 mg/kg,i.p.)或生理盐水(i.p.)刺激,4h后取脑,进行免疫荧光实验。免疫荧光结果显示,仅在刺激取脑前1天给予Dox,Teton系统能够在甲基苯丙胺刺激后启动mCherry的表达,且不给予Dox时mCherry几乎不表达,说明Teton系统的开放受Dox调控。在Dox存在的情况下,与盐水组相比,给予甲基苯丙胺之后VTA中同时表达Fos和mCherry的神经细胞增加,说明甲基苯丙胺能够通过增加VTA中Fos的表达启动Teton系统。且与刺激取脑前6天和前3天给予Dox组相比,刺激取脑前1天给予Dox组腹腔注射盐水后mCherry的非特异性表达(即非甲基苯丙胺刺激引起的表达)较低。以上结果显示,在Dox存在的情况下,甲基苯丙胺能够通过激活Fos的表达来诱导Teton系统的启动,且在刺激取脑前1天给予Dox能够在启动系统表达的同时减少mCherry的非特异性表达。结论综上所述,本课题在行为学上揭示,与感觉刺激的联合学习记忆相似,联合学习记忆对于药物和线索各自引起的反应具有双向的增强作用。巴甫洛夫联合学习通过增强甲基苯丙胺单一刺激诱发的用药动机,促进小鼠甲基苯丙胺自身给药的形成;且减慢甲基苯丙胺成瘾的环境消退过程,为甲基苯丙胺成瘾联合学习记忆机制的存在提供了行为学证据。这些结果提示联合学习记忆不仅是药物相关线索的条件性强化和内生动机的基础,而且能够直接、双向的增强甲基苯丙胺成瘾和环境消退抵抗。本课题强调甲基苯丙胺成瘾和复吸背后可能的联合学习记忆机制,这可能在介导甲基苯丙胺成瘾形成以及情境、离散线索、药物诱发的复吸中发挥重要的作用。本课题为药物成瘾联合学习记忆的研究提供了可靠的行为学范式,为进一步发现成瘾联合学习记忆细胞,进而阐明甲基苯丙胺成瘾的联合学习记忆机制奠定了坚实的基础,有望揭示甲基苯丙胺成瘾难以戒除背后的神经生物学机制,对发现有效的治疗甲基苯丙胺成瘾防复吸干预措施具有重要的意义。