胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是器官对胰岛素敏感度降低的病理性过程,肝脏是其靶器官之一,机体对葡萄糖吸收效率的降低。为了满足机体需求,胰岛素会分泌大量的胰岛素,从而导致高胰岛素血症,同时机体会表现出糖原合成能力下降、肝糖原输出和糖异生增强。因此,减轻胰岛素抵抗,增加肝脏胰岛素敏感性,是治疗糖尿病的重要措施。miR-122是一个肝脏特异性miRNA,参与脂代谢、氧化应激反应、炎症、肿瘤发生、病毒感染等。miR-122对脂代谢的作用已被多篇文献证实,miR-122的沉默可以抑制糖尿病动物体内脂肪合成,促进脂肪酸降解,有效降低血脂水平。在2型糖尿病及糖耐量受损的患者血清中,miR-122均有所升高,提示miR-122与2型糖尿病的相关性。本研究通过高脂高糖联合小剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型,观察miR-122在糖尿病大鼠肝脏的表达及调节糖脂代谢的作用机制,为深入探讨糖尿病的病理机制和防治糖尿病提供新的靶点。第一部分2型DM模型大鼠肝脏miR-122表达和IGF-1R、p-Akt和Akt的蛋白表达目的:应用小剂量链脲佐菌素联合高脂喂养大鼠,构建近似2型糖尿病大鼠模型,观察在糖尿病模型大鼠肝脏中miR-122表达,以及糖脂代谢及胰岛素信号通路中关键基因的蛋白表达的变化,为miR-122在糖尿病中的作用机制研究提供理论依据。方法:选取雄性健康SD大鼠,随机分为对照组(normal diet,ND)和高脂组(high fat diet,HFD)。ND组喂食普通饲料,HFD组食高糖高脂饲料,6周后,禁食16 h,HFD组大鼠一次性左下腹腔注射链脲佐菌素,继续喂食后两天后,测定HFD组尾部静脉血中空腹血糖的浓度,如果空腹血糖浓度大于11.1 mmol/L则视为造模成功。纳入2型糖尿病大鼠组(DM),对两组大鼠的一般指标、生化指标、糖耐量、肝脏组织、胰岛素敏感性指数进行测定,提取血清及肝脏组织miRNA,应用实时荧光定量PCR技术检测miR-122表达水平,应用Western blot技术检测胰岛素信号通路中关键蛋白IGF-1R、p-Akt和Akt的蛋白表达变化。结果:1.成功建立了2型糖尿病大鼠模型(1)与ND组比较,DM组饮食、饮水日摄取量增加,体重下降,差异有统计学意义(P<0.05);肝指数DM组大鼠较ND组升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)与ND组比较,DM组FPG、空腹血清胰岛素、TG、TC、FFA水平均升高,QUICKI值显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05),与ND组比较,DM组QUICKI值降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示2型糖尿病大鼠胰岛素敏感性降低。(3)DM组0 min、30 min、60 min、90 min、120 min时间点的血糖、血清胰岛素水平均明显高于ND组,差异均有统计学意义(P<0.001),与ND组相比,DM组的葡萄糖曲线下面积也明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。(4)DM组肝脏组织小叶中央区受累明显,肝细胞排列紊乱,肝索和肝血窦排列紊乱;肝细胞体积增大变圆、胞浆疏松,胞浆内有较多空泡形成,呈明显的脂肪变性。ND组大鼠肝脏组织细胞形态无异常,未见脂肪变性。(5)与ND组相比,DM组大鼠肝组织PAS染色较浅,提示肝组织糖原含量降低,差异有统计学意义(P<0.001)。2.两组大鼠肝脏miR-122的表达水平比较Real-time PCR对两组大鼠肝脏miR-122进行定量分析,与ND组比较,DM组大鼠肝脏的miR-122表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。3.两组大鼠血清miR-122水平比较Real-time PCR对两组大鼠血清miR-122进行定量分析,与ND组比较,DM组大鼠血清miR-122水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。4.两组大鼠胰岛素信号通路中关键基因的蛋白表达的变化与ND组相比,DM组大鼠肝脏组织Akt总蛋白的表达无明显变化,(P>0.05),但Akt蛋白的磷酸化水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);DM大鼠肝脏组织IGF-1R蛋白的表达减少,差异有统计学意义(P<0.001)。第二部分下调miR-122表达对Hep G2细胞胰岛素抵抗及糖代谢的影响目的:通过抑制胰岛素抵抗Hep G2细胞的miR-122水平,深入了解抑制miR-122表达对胰岛素信号通路及肝细胞糖代谢的影响,从而揭示miR-122对胰岛素敏感性及糖代谢的作用,对其作用的分子机制进行探讨。方法:利用葡萄糖胺诱导Hep G2细胞,建立胰岛素抵抗的细胞模型,利用荧光定量PCR方法检测胰岛素抵抗的模型Hep G2细胞中miR-122水平变化,通过Western blot检测IGF-1R/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达;通过miR-122-inhibitor转染胰岛素抵抗Hep G2细胞,抑制Hep G2细胞miR-122水平,进一步观察Hep G2细胞葡萄糖摄取和细胞葡萄糖代谢关键酶表达变化。结果:1.成功构建了Hep G2细胞的IR模型经葡萄糖胺处理12小时后,Hep G2细胞中2-DG6P量明显低于正常培养的细胞,差异有统计学意义(P<0.001),证实葡萄糖胺处理可降低Hep G2细胞的胰岛素敏感性,胰岛素抵抗细胞模型构建成功。2.葡萄糖胺处理细胞后miR-122的表达变化与Control组相比,IR组的miR-122表达升高,差异有统计学意义(P<0.01)。3.葡萄糖胺处理细胞后IGF-1R/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响与Control组相比,在IR组中IGF-1R表达明显减少,Akt总蛋白表达无明显变化,但Akt蛋白的磷酸化水平降低,差均有统计学意义(P<0.05)4.抑制Hep G2细胞miR-122的水平对IGF-1R/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响与Control组相比,在IR组中IGF-1R表达明显减少,Akt总蛋白表达无明显变化,但Akt总蛋白的磷酸化水平降低,差异有统计学意义(P<0.001)。下调Hep G2细胞miR-122的表达后,与对照组inhibitor-NC组相比,miR-122-inhibitor组IGF-1R蛋白表达明显增多(P<0.001),Akt总蛋白的表达仍无显著性改变,但Akt总蛋白的磷酸化水平升高(P<0.001),下调miR-122表达后,Hep G2细胞胰岛素敏感性有所改善。5.miR-122的下调对糖代谢的影响(1)与Control组相比,IR组Hep G2细胞中2-DG6P浓度明显下降(P<0.001),葡萄糖摄取率降低;miR-122-inhibitor组下调Hep G2细胞miR-122的表达后,培养基中2-DG6P浓度明显升高(P<0.01),说明葡萄糖摄取率升高。(2)与Control组相比,IR组G6Pase和PEPCK基因表达量均明显升高(P<0.001);下调miR-122的表达后,G6Pase和PEPCK m RNA均明显降低(P<0.05)。第三部分miR-122潜在作用靶点的预测和验证目的:明确miR-122对肝脏胰岛素敏感性及糖代谢的调节作用的基础上,进一步应用生物信息学方法筛选miR-122影响肝脏胰岛素敏感性的潜在靶分子,并对预测结果进行体外实验验证。方法:分别用Target Scan、Pictar和MICROCOSM micro RNAs专业预测软件对miR-122进行靶基因预测扫描,寻找miR-122潜在的m RNA靶点;将Hep G2细胞分为模拟物对照组(NC mimics组)、miR-122模拟物组、抑制物对照组、miR-122抑制物组,并进行相应的细胞转染处理,通过Western blot分析各处理组细胞中靶点蛋白的表达水平变化;进一步采用荧光素酶报告基因分析验证miR-122对靶基因的作用及结合位点。结果:1.转染miR-122 mimics后Hep G2细胞miR-122水平变化荧光定量PCR结果显示,转染miR-122 mimics后,Hep G2细胞miR-122水平较NC mimics组和parental组明显升高,差异有统计学意义(P<0.001),与parental组相比,NC mimics组无明显变化(P>0.05)。2.miR-122靶点预测分析通过micro RNA数据库Target Scan(http://www.targetscan.org/)预测miR-122的潜在靶基因。通过预测发现IGF-1R是miR-122的潜在靶点。通过miR-122和IGF-1R 3’-UTR的序列比对,查找到二者潜在的结合位点。3.miR-122对IGF-1R蛋白表达的影响miR-122 Mimics转染Hep G2细胞,证实miR-122的表达上调;同时,Western-blot检测结果显示,与对照mimic-NC组相比,IGF-1R的蛋白表达明显下降。将miR-122 inhibitor转染入Hep G2细胞,Hep G2细胞miR-122的表达下调;与对照组inhibitor-NC组相比,IGF-1R的蛋白表达明显升高。4.miR-122预测靶点IGF-1R的3’-UTR报告基因验证IGF-1R的3’-UTR野生型质粒(IGF-1R-3’UTR-wt)和miR-122 mimics共转染Hep G2细胞后,荧光素酶活性较NC mimics对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);而IGF-1R的3’-UTR突变型质粒(IGF-1R-3’UTR-mut)和miR-122 mimics共转染Hep G2细胞后,荧光素酶活性较较NC mimics对照组无明显变化(P>0.05)。第四部分IGF-1R沉默对Hep G2细胞胰岛素抵抗及糖代谢的影响目的:通过沉默IGF-1R表达,观察miR-122影响细胞胰岛素抵抗中的作用。方法:建立Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,通过si RNA干扰Hep G2细胞的IGF-1R基因表达,然后抑制内源性miR-122表达。将Hep G2细胞按不同转染方式分为对照si RNA组(NC si RNA)、IGF-1R si RNA组(IGF-1R si RNA)、抑制物对照组(NC inhibitor+IR)、miR-122抑制物组(miR-122 inhibitor+IR)、miR-122抑制物联合对照si RNA组、miR-122抑制物联合IGF-1R si RNA组,分别进行细胞转染。采用荧光定量PCR和Western blot检测各组Hep G2细胞中IGF-1R、G6Pase基因及蛋白的表达水平。结果:1.Hep G2细胞中IGF-1R小干扰RNA转染效果检测设计并合成针对人IGF-1R的小干扰RNA,转染Hep G2细胞,Western blot分析表明,与对照组比较,IGF-1的蛋白表达水平明显降低。差异有统计学意义(P<0.01)。2.转染IGF-1R si RNA对诱导胰岛素抵抗Hep G2细胞IGF-1R m RNA表达的影响通过果糖诱导并建立Hep G2细胞胰岛素抵抗模型。荧光定量PCR结果显示,与NC inhibitor+IR组相比,miR-122 inhibitor+IR组IGF-1R m RNA的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);转染IGF-1R si RNA后,与miR-122 inhibitor+NC si RNA+IR组相比,miR-122 inhibitor+IGF-1R si RNA+IR组IGF-1R的m RNA表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.沉默IGF-1R表达对诱导胰岛素抵抗Hep G2细胞葡萄糖摄取的影响与NC inhibitor+IR组相比,miR-122 inhibitor+IR组中2-DG6P明显增多,葡萄糖摄取增加,差异有统计学意义(P<0.01);与miR-122inhibitor+NC si RNA+IR组相比,miR-122 inhibitor+IGF-1R si RNA+IR组2-DG6P明显减少,葡萄糖摄取明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.沉默IGF-1R表达对诱导胰岛素抵抗Hep G2细胞糖异生关键酶G6Pase、PEPCK m RNA表达的影响Hep G2细胞诱导胰岛素抵抗后,与NC inhibitor+IR组相比,miR-122inhibitor+IR组G6Pase、PEPCK的m RNA表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);沉默IGF-1R表达后,与miR-122 inhibitor+NC si RNA+IR组相比,miR-122 inhibitor+IGF-1R si RNA+IR组G6Pase、PEPCK的m RNA表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。第五部分不同糖耐量人群血清miR-122水平与HOMA-β和HOMA-IR的相关性研究目的:探讨观察不同糖耐量人群血清miR-122水平与胰岛素抵抗、糖脂代谢及胰岛β细胞功能之间的关系,为2型糖尿病的临床诊断和发生发展机制研究提供理论参考。方法:选取河北省人民医院体检中心进行体检人群,年龄在35~65岁之间的研究对象261名,所有受试者均行75g口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)。根据糖耐量试验结果,将受试者分为2型糖尿病组(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)、糖调节受损组(impaired glucose regulation,IGR)和糖耐量正常组(Normal glucose tolerance,NGT)。收集年龄、性别、BMI、WHR等一般参数;采集静脉血,检测Hb A1c、FBG、PBG、FINS、2h INS、TC、TG、HDL-C,LDL-C等生化指标并计算HOMA-IR、HOMA-β数值;定量PCR检测血清miR-122水平;SPSS 21.0软件分析血清miR-122水平与上述指标的相关性。本研究经医院伦理委员会批准,受试者均签订知情同意书。结果:1.各组间一般资料和血生化指标的比较三组间年龄、性别、BMI和WHR差别无统计学意义(P>0.05)。PBG、FINS、2h INS、Hb A1c在NGT组、IGR组和T2DM组间呈逐渐上升趋势,组间相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。三组间HOMA-IR有统计学差异(P<0.01),其中IGR组HOMA-IR高于NGT组(P<0.05),而T2DM组HOMA-IR明显高于IGR组和NGT组(P<0.01)。NGT组、IGR组、T2DM组的HOMA-β呈逐渐降低的趋势,其中,T2DM组HOMA-β显著降低,且各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。对各组脂代谢相关指标进行比较发现,NGT组、IGR组、T2DM组在TC、TG水平呈现逐渐升高的趋势,其中IGR组和T2DM组的TC、LDL-C、TG水平均高于NGT组,但TC、LDL-C、TG仅在NGT组和IGR组有统计学差异(P<0.05)。2.各组间血清miR-122水平比较定量PCR检测结果显示,T2DM组的miR-122水平高于NGT组和IGR组,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。IGR组的miR-122水平高于NGT组,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-122在三组间差异有统计学意义(P<0.01)。3.血清miR-122水平与各代谢指标的相关性Spearman线性相关分析结果表明,血清miR-122水平与BMI、WHR、FBG、PBG、Hb A1c、TC、TG、LDL-C、餐后2小时胰岛素水平、空腹胰岛素水平、HOMA-IR、HOMA-β都具有显著的相关性(P<0.05)。4.血清miR-122水平的影响因素多元线性逐步回归分析结果显示,HOMA-IR、HOMA-β是血清miR-122水平的重要影响因素。5.血清miR-122水平与T2DM发生率的相关关系根据miR-122表达水平从低到高将研究对象分为四组,分别为Q1(0.78~1.23)、Q2(1.24~1.87)、Q3(1.88~2.23)、Q4(2.24~3.46),比较结果表明,不同miR-122水平人群T2DM的发生率分别为:15.36%、26.74%、49.34%、62.23%。结论:1.肝脏miR-122的表达水平与胰岛素抵抗和糖尿病的发生、发展密切相关。2.miR-122通过靶向作用IGF-1R的表达调控肝脏胰岛素信号通路和糖代谢过程。3.测定人血清miR-122水平对于评估胰岛素抵抗和糖尿病发生、发展具有一定的临床意义。