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研究背景及目的:肝癌为全球第六大恶性肿瘤,其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）约占90%。目前HCC的发病率与死亡率均高居肿瘤前列,且治疗效果不佳,复发率高。HCC发病机制复杂,目前尚未研究清楚,也缺乏有效的靶向药物和治疗手段。因此深入研究肝细胞癌发展的分子机制,识别与肿瘤表型相关的合适靶分子和信号通路,是开发有效靶向治疗肝癌药物的关键。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3,GPC3）是glypican家族的一员,通过GPI锚定在细胞膜上。GPC3在正常组织不表达或低表达,但在HCC中高表达,高表达的GPC3通过刺激典型的Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞的生长、增殖、粘附和迁移。但GPC3在缺氧状态下的表达与调节机制尚未见报道。缺氧是肿瘤发展过程中的常态,主要通过调节缺氧诱导因子1α（Hypoxia-Inducible Factor 1-Alpha,HIF-1α）启动下游基因的表达,抑制抗肿瘤免疫细胞活性,促进癌细胞免疫逃逸,进而促进肿瘤细胞的生长和转移,特别是在肝癌的发展过程中,发挥着重要作用。然而缺氧对HCC的调控机制复杂,目前尚未完全研究清楚。最新研究发现,外泌体也参与了肝癌的发生与发展。外泌体通过其携带的生物活性物质,进而激活靶细胞信号通路的活化,促进肿瘤进展。外泌体的形成与分泌受一系列小分子蛋白的调节,包括Rab蛋白和N-乙基马来酰亚胺敏感融合因子附着蛋白受体家族（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SNARE）复合体。有报道显示,GPC3也存在于外泌体中,但GPC3的分泌机制以及外泌体GPC3在HCC中的作用并不清楚。本研究旨在探讨缺氧对GPC3表达和分泌的作用及机制,以及外泌体GPC3在促肝细胞癌增殖、迁移的作用机制,为进一步明确HCC的发展提供理论基础。方法:（1）将Huh7细胞给予1%O2处理不同时间后:RT-qPCR检测细胞内GPC3、HIF-1α的表达,Western Blot和免疫荧光检测细胞内GPC3、HIF-1α、STX11和SYT7的表达;采用超高速离心法提取细胞上清外泌体,透射电镜观察外泌体形态,纳米粒径追踪分析（NTA）检测外泌体浓度及粒径大小,Western Blot检测外泌体标记蛋白HSP70、Alix、CD63和GPC3的表达;（2）合成靶向HIF-1α的si RNA,采用脂质体转染法将50n M的si RNA转染Huh7细胞6h后给予1%O2处理24h,Western Blot和免疫荧光检测HIF-1α、GPC3、STX11和SYT7的表达;采用Crispr cas9基因敲除技术构建HIF-1α敲低的稳转细胞系,将稳转细胞系给予1%O2处理24h后,采用超高速离心法提取上清外泌体,Western Blot检测外泌体标记蛋白Alix、HSP70、CD63的表达,NTA检测外泌体的粒径大小和浓度;（3）Huh7细胞分别加入0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的GW4869孵育2h后,再给予1%O2处理24h后,Western Blot检测细胞内GPC3的表达水平;20μmol/L的GW4869处理Huh7细胞2h后给予1%O2处理24h,免疫荧光检测细胞内GPC3的荧光强度;（4）采用Crispr cas9基因敲除技术构建GPC3敲低稳转细胞系,超高速离心法提取细胞外泌体,用PKH67染料标记外泌体后,以20μg/m L外泌体重新孵育Huh7细胞24h,超分辨激光共聚焦荧光显微镜观察外泌体吸收情况;分别提取GPC3敲低细胞系和对照组细胞系外泌体,再以20μg/m L外泌体重新孵育Huh7细胞24h-48h,Western Blot检测PCNA、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、C-myc、β-catenin、GSK-3β、Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表达水平;共聚焦高内涵成像分析系统检测细胞的增殖;划痕实验检测细胞的迁移能力;用m Cherry-GFP-LC3双荧光质粒转染Huh7细胞6h后,分别以20μg/m L正常分泌GPC3细胞系来源外泌体和GPC3敲低细胞系外泌体重新孵育Huh7细胞12h,超分辨激光共聚焦荧光显微镜下观察自噬小体。（5）4周龄裸鼠,随机分为对照组、正常分泌GPC3细胞系外泌体组和GPC3敲低细胞外泌体组。将1×107/m L Huh7细胞和250μg外泌体混匀,每只裸鼠200u L皮下成瘤。25天后,用0.1%戊巴比妥钠使小鼠安乐死,观察裸鼠肿瘤大小;取出裸鼠肿瘤组织,免疫组化染色检测Vimentin、PCNA、C-myc阳性表达率。结果:（1）与对照组相比,1%O2上调细胞内GPC3的m RNA水平,但呈时间依赖式下调细胞内GPC3的蛋白水平（P＜0.05）。同时,与对照组相比,缺氧促进外泌体以及外泌体GPC3的分泌,上调外泌体标记蛋白Alix、HSP70、CD63的表达,下调外泌体分泌调节蛋白STX11和SYT7的表达（P＜0.05）。（2）与对照组相比,干扰HIF-1α上调细胞内GPC3的蛋白水平,抑制外泌体分泌,下调外泌体标记蛋白Alix、HSP70、CD63的表达,但上调外泌体分泌相关蛋白STX11和SYT7的表达（P＜0.05）。（3）与对照组相比,细胞内GPC3的蛋白水平随GW4869浓度的上调而上调;与对照组相比,缺氧下调细胞内GPC3的蛋白水平,但加GW4869预处理后,细胞内GPC3的蛋白水平恢复上调（P＜0.05）。（4）PKH67染色显示外泌体可以被肝癌细胞自吸收;与对照组相比,GPC3正常组外泌体促进Huh7细胞的增殖和迁移,促进小鼠肿瘤的生长,上调N-cadherin、Vimentin、PCNA、Cyclin D1、下调E-cadherin的表达（P＜0.05）;与GPC3正常组外泌体相比,GPC3敲低组外泌体下调N-cadherin、Vimentin、PCNA、Cyclin D1蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达（P＜0.05）。（5）和对照组相比,正常分泌GPC3组外泌体上调Wnt/β-catenin信号通路蛋白C-myc、β-catenin的表达,下调GSK-3β的表达（P＜0.05）;与正常分泌GPC3组外泌体相比,GPC3敲低组外泌体下调Huh7细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白C-myc、β-catenin的表达,上调GSK-3β的表达（P＜0.05）（6）和对照组相比,正常分泌GPC3组外泌体上调自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表达,下调p62的表达,且细胞内自噬流增强（P＜0.05）;与正常分泌GPC3组外泌体相比,GPC3敲低组外泌体下调自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表达,上调p62的表达,且细胞内自噬流减弱（P＜0.05）。结论:缺氧通过HIF-1α促进外泌体GPC3的分泌;外泌体GPC3通过Wnt/β-catenin信号通路和自噬影响肝癌细胞的增殖和EMT。