【摘 要】
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目的:本研究运用系统生物信息学工具与网络药理学分析方法,以阐释熊果酸（Ursolic acid,UA）干预三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）的潜在分子机制及关键靶点,并通过体外实验进一步验证有效性,为UA作为中药天然化合物治疗TNBC提供药理学证据及新药研发指导。方法:1.UA对TNBC细胞系功能学影响:通过CCK8法分别测试不同药物浓度下的UA干
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目的:本研究运用系统生物信息学工具与网络药理学分析方法,以阐释熊果酸（Ursolic acid,UA）干预三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）的潜在分子机制及关键靶点,并通过体外实验进一步验证有效性,为UA作为中药天然化合物治疗TNBC提供药理学证据及新药研发指导。方法:1.UA对TNBC细胞系功能学影响:通过CCK8法分别测试不同药物浓度下的UA干预TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468后细胞活力的变化。伤口愈合实验和体外侵袭实验分别检测不同浓度UA对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系迁移能力及侵袭能力产生的影响。流式细胞术检测被用来评估在接受不同浓度UA处理后MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞凋亡情况。2.TNBC微阵列基因芯片获取和处理:运用R语言在GEO数据库下载TNBC相关芯片数据,并借助Rstudio中的“affy”软件包进行标准化处理。随后,使用“limma”语言包进行差异表达分析（differentially expressed genes analysis,DEGs）。DAVID数据库被用来对DEGs基因进行富集分析。同时,DEGs基因被导入STRING在线工具以构建蛋白质相互作用网络,最后,通过拓扑分析获得TNBC的候选靶点基因。3.分子对接,预后价值评估及GSEA富集分析:将本研究获得的TNBC候选差异基因与UA小分子化合物进行分子对接,通过对接打分,选择具有最高结合度的关键靶基因作为研究对象,并进行预后价值分析及GSEA富集分析。4.UA对TNBC关键靶点的影响:通过实时荧光定量PCR及Western Blot分别检测不同浓度UA对TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468后关键靶点在转录和蛋白表达水平的影响。结果:1.本研究的细胞功能学实验显示,TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468经过UA处理后细胞增殖受到抑制,且具有时间和浓度依赖性（P<0.05）;细胞伤口愈合实验和侵袭实验显示,UA可以显著TNBC细胞的迁移及侵袭能力（P<0.05）;流式细胞术检测结果表明,经过UA处理后,TNBC细胞的凋亡百分比呈浓度依赖的方式显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.运用R语言在GEO数据库中筛选获得2张TNBC相关基因芯片GSE45827和GSE65194,整合并去除批次效应后进行差异表达分析,得到724个DEGs基因。根据靶点连通度（degree）最高等级进行的综合排名的拓扑分析结果,确定前15个DEGs基因作为进一步分析的候选靶基因,包括CDK1、CCNA2、CDC20、CCNB1、CCNB2、MAD2L1、AURKB、TOP2A、BUB1B、KIF11、PLK1、CDCA8、NCAPG、KIF2C和UBE2C。3.分子对接表明,在15个候选靶点与UA小分子化合物的对接结果中,PLK1（对接得分:5.9357）和CCNB1（对接得分:5.2448）与UA的结合度最佳,故PLK1和CCNB1被确定为关键靶点。预后分析显示,PLK1和CCNB1的高表达与患者不良预后呈负相关（P<0.05）。同时,GSEA富集结果显示,PLK1和CCNB1共同显著富集于P53信号通路,其中PLK1和CCNB1可能通过P53基因调控。因此,PLK1,CCNB1和P53被作为后续实验验证的核心靶点。4.实时荧光定量PCR和Western Blot检测显示,相较于空白对照组,经过UA处理后,TNBC细胞中PLK1和CCNB1的mRNA和蛋白表达均呈浓度依赖性降低,P53的mRNA和蛋白表达随着浓度增加而上调。差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:本研究表明,UA作为中药天然化合物可以显著抑制TNBC细胞的增殖,迁移,侵袭并诱导细胞凋亡。其中UA干预TNBC的潜在分子机制可能涉及调控P53来影响PLK1和CCNB1的表达,从而在TNBC治疗中发挥关键作用。这些发现从系统的角度阐释了UA治疗TNBC的分子和药理机制,为UA通过多靶点干预TNBC提供了有力的证据。
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