圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫基因型鉴定及虫种群体遗传结构分析

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大熊猫是我国的国宝,属于珍稀易危野生动物。肠道寄生虫病是大熊猫常见的疾病之一。目前为止,寄生于大熊猫肠道的寄生虫至少包括9种,其中含4种原虫(大熊猫隐孢子虫、安氏隐孢子虫、刚地弓形虫、毕氏肠微孢子虫)。毕氏肠微孢子虫属于专性细胞内寄生性真核生物,能够感染人、野生动物、家养动物等脊椎动物和无脊椎动物,造成宿主的腹泻及消耗性综合征。为了解圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫的感染情况,本试验在成都大熊猫繁育研究基地(n=75)、都江堰大熊猫基地(n=30)、卧龙耿达大熊猫基地(n=37)、雅安碧峰峡大熊猫基地(n=17)、卧龙核桃坪大熊猫基地(n=10)、15个动物园(n=31)共采集了200份圈养大熊猫粪便样品,提取DNA后,经巢式PCR扩增ITS基因位点,PCR产物通过测序后进行种系发育分析。结果显示:共有69只大熊猫感染了毕氏肠微孢子虫,总感染率为34.5%。不同基地与动物园的大熊猫、不同性别的大熊猫、不同年龄的大熊猫毕氏肠微孢子虫感染率无显著性差异(P>0.05)。基于ITS位点,共鉴定到12种基因型,包括7种已报道的基因型(SC02、EpbC、CHB1、SC01、D、F、Peru 6)和5种新基因型(SC04、SC05、SC06、SC07、SC08)。种系发育分析显示,除了CHB1,其余11种基因型均属于人兽共患遗传组1(group 1),揭示了其人兽共患性。为鉴定大熊猫毕氏肠微孢子虫分离株的多位点基因型,本试验通过巢式PCR法扩增了阳性样品的微卫星(MS1、MS3、MS7)位点和小卫星(MS4)位点。结果表明,在MS1、MS3、MS4和MS7位点分别成功扩增48、45、50、47个样本,产生了10、8、9、5个基因型(type)。有36个样本在5个位点均成功扩增,形成了24个多位点基因型(MLGs)。毕氏肠微孢子虫在微卫星和小卫星位点的序列多态性包括了单核苷酸多样性(SNP)和片段长度多态性。基于小卫星位点和微卫星位点的系统发育分析结果表明,毕氏肠微孢子虫存在两个系统进化组:包含人兽共患基因型的系统进化组(具有人兽共患潜能)、包含具有宿主特异性基因型的系统进化组。为获得大熊猫毕氏肠微孢子虫的群体遗传结构,对69份阳性样品基于ITS、MS1、MS3、MS4、MS7五个遗传位点进行了研究分析。强烈的基因内连锁不平衡(LD)和有限的遗传重组表明该群体可能为克隆性群体。基于等位基因型分布的配对基因间LD分析和标准群丛指数(IAS)值再次表明该群体为克隆性群体,并且处于连锁不平衡状态。STUCTURE分析结果表明该群体形成了3个亚群体,Wright’s固定指数(FST)也证实了形成的亚群体是可靠的、存在的。其中,亚群体1与亚群体2为流行性结构,而亚群体3为克隆性结构。综上所述,我国圈养大熊猫毕氏肠微孢子虫的感染率较高(34.5%),主要感染SC02基因型,具有人兽共患潜能,且大熊猫源毕氏肠微孢子虫具有较高的遗传多样性。本研究首次鉴定了大熊猫毕氏肠微孢子虫的群体遗传结构,总群体为克隆性群体结构。本研究结果为大熊猫微孢子虫病的防控提供了依据。
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