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目的:乳腺癌在女性肿瘤中引起的发病率及死亡率最高,严重危害女性健康。乳腺癌是一种全身性疾病,其中HER2阳性乳腺癌是指免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测HER2(human epidermal growth factor receptor-2)+++,或原位杂交(in situ hybridization,ISH)检测为阳性的乳腺癌。20%~30%的乳腺癌中存在HER2过表达,HER2阳性乳腺癌的恶性程度高,易出现局部或远处淋巴结转移,预后差。分子生物学研究发现,HER2阳性乳腺癌同样作为一种异质性群体存在。根据2013版乳腺癌的分子分型,大部分HER2阳性乳腺癌为HER2阳性型(非Luminal型),一小部分属于Luminal B型中的Luminal B-like(HER2阳性)型,预后较差。对于HER2阳性乳腺癌常规予以抗HER2治疗,但有效率不高。如何提高HER2阳性乳腺癌的治疗效果,寻找更加有效的治疗措施,已成为乳腺癌治疗的重点和难点。因此,进一步探索HER2阳性乳腺癌的发病机制,寻找有效的乳腺癌治疗方法势在必行。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族,它的成员包括:ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER2、ErbB-3/HER3和ErbB-4/HER4,与乳腺癌的发生、进展及转移关系密切。表皮生长因子受体通过与配体(如EGF)结合形成同源或异源二聚体,进而激活下游的信号转导通路,如MAPK/ERK、PI3K/Akt等,最终促进肿瘤的增殖、侵袭、转移及血管生成。至今仍未发现HER2有明确的配体,但它可与EGFR家族中其他成员形成异源二聚体或自身形成同源二聚体。HER2在多种组织中均有表达,如乳腺、胃、结直肠等,生理情况下调控着组织内细胞的增殖和分化,而异常活化则会导致肿瘤生长、复发和转移。研究报道,HER2过表达是乳腺癌预后不良的独立预测指标。因此,HER2成为了一个重要治疗靶点。目前针对HER2的分子靶向药物如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等已应用于乳腺癌的临床治疗,但其单独应用的有效率不高且存在耐药问题,提示在HER2过表达的乳腺癌中仍有未知的信号分子调节HER2信号通路的转导,对乳腺癌的发生具有重要影响。细丝蛋白A(Filamin A,FLNa)又称肌动蛋白结合蛋白280(actin-binding protein 280,ABP-280),分子量280k Da,由Stossel等首次发现于非肌肉组织的肌动蛋白细丝交联蛋白中。全长的FLNa主要定位于细胞质,容易发生蛋白分解。其90k Da的裂解片段可以定位于细胞核。FLNa是“V”形的同型二聚体,由肌动蛋白结合区、24个重复的β-折叠片层和2个绞链区组成。FLNa的特殊结构决定其具有强大的功能:FLNa分子可交联肌动蛋白丝形成稳定的细胞骨架,并与多种细胞膜蛋白结合,调节如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多条信号转导通路的活化,最终影响肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭等生物学行为。Zhu等认为FLNa可以调控人恶性黑色素瘤细胞EGFR的活化,EGFR与HER2属同一家族,而FLNa能否参与HER2阳性乳腺癌细胞的活化目前并无相关报道。本研究拟通过:(1)用质粒转染技术建立下调FLNa的HER2阳性乳腺癌MDA-MB-453稳定细胞株;(2)采用MTS法、划痕修复实验、Transwell法检测稳定转染细胞株的增殖、迁移和侵袭能力;(3)采用Western blot法,检测HER2及其下游信号转导通路中各激酶的活化水平。意在从细胞、分子水平探讨FLNa对HER2阳性乳腺癌细胞MDA-MB-453增殖、迁移和侵袭的调节机制,研究FLNa下调对HER2活化及其下游信号转导的影响,为更精准地治疗HER2阳性乳腺癌提供有效的靶点。方法:1质粒转染技术构建下调FLNa的稳定细胞株将FLNa sh RNA质粒转染到人HER2阳性乳腺癌细胞MDA-MB-453中,经嘌呤霉素筛选,获得下调FLNa的稳定转染细胞株(MDA-MB-453/KD)及其对照组细胞株(MDA-MB-453/Ctrl);利用Western blot检测其中FLNa的蛋白水平。2 MTS法检测稳定转染细胞株的增殖能力将MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl细胞消化后各自接种到96孔板中,饥饿培养4h后,予不同浓度EGF(0n M、4n M、20n M、100n M)分别刺激培养48h,加入MTS,酶标仪上检测各孔的OD值。通过比较各组之间的差别来测定细胞的增殖情况。3通过划痕修复实验来检测MDA-MB-453细胞株转染后的迁移情况将MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl细胞各自接种于24孔板,饥饿培养4h后,用10ul枪头在底部划痕。两组细胞均分为无EGF刺激组和20n M EGF刺激组;置于显微镜下观察划痕修复情况,定时进行拍照,直至划痕愈合。4 Transwell实验测定MDA-MB-453细胞转染后的侵袭情况将基质胶铺于Transwell小室的上室,MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl两组细胞消化后分别铺于小室上室,在无FBS的1640培养液中培养,下室放入含10%胎牛血清1640培养液中,培养6天后;取出小室,用95%冰乙醇固定、HE染色,显微镜下拍照并计数穿膜细胞数。5 Western blot检测HER2活化水平及其下游信号转导通路分子的变化将MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl细胞分别接种于35mm培养皿,无胎牛血清的1640培养基饥饿4h,经20n M EGF刺激后,于不同时间(0min、5min、10min、30min)收集细胞,提取总蛋白;采用Western blot检测FLNa、p-HER2、HER2、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK的水平,以b-actin作为内参蛋白。结果:1稳定转染细胞中FLNa蛋白表达水平的检测采用Western blot检测稳转细胞株中FLNa蛋白的表达水平,实验结果如下,MDA-MB-453/KD细胞FLNa的相对表达量(0.60±0.05)明显少于MDA-MB-453/Ctrl细胞(1.05±0.01),具有统计学差异(P<0.01)。2检测稳定转染细胞的增殖、迁移、侵袭能力2.1MDA-MB-453细胞转染后的增殖能力采用MTS法检测MDA-MB-453细胞稳转后的增殖情况:各浓度EGF(0n M、4n M、20n M、100n M)刺激的MDA-MB-453/KD组细胞的OD值(1.26±0.03,1.39±0.01,1.55±0.02,1.82±0.04)明显高于MDA-MB-453/Ctrl组(0.88±0.02,0.98±0.03,1.07±0.14,1.38±0.09),具有统计学差异(P<0.01)。2.2MDA-MB-453细胞转染后的迁移能力采用Wound healing实验测定MDA-MB-453稳转株的迁移情况:无EGF刺激时,MDA-MB-453/KD细胞在不同时间点的迁移率(23.06±0.14%,23.26±0.14%,39.62±0.04%,47.16±0.16%)均明显高于MDA-MB-453/Ctrl组(7.85±1.08%,7.85±1.87%,12.15±0.53%,20.93±1.39%),具有统计学差异(P<0.01);给予20n M EGF刺激时,MDA-MB-453/KD组细胞不同时间点的迁移率(30.16±0.62%,36.59±0.77%,42.87±1.53%,50.00±0.00%)亦明显高于MDA-MB-453/Ctrl组(13.34±0.51%,14.38±1.18%,15.80±1.56%,25.65±0.43%),有统计学差异(P<0.01)。2.3 MDA-MB-453稳转细胞株的侵袭能力采用Transwell实验检测MDA-MB-453稳转株的侵袭情况:MDA-MB-453/KD组平均穿膜细胞数(3±0.23)明显高于MDA-MB-453/Ctrl组(14±0.44),具有统计学差异(P<0.01)。3 MDA-MB-453细胞转染后HER-2活化水平及其下游信号转导通路分子的变化采用Western blot实验测定MDA-MB-453稳转细胞在20n M EGF刺激0min、5min、10min、30min后各蛋白的表达水平:MDA-MB-453/KD组FLNa的表达量(0.22±0.02,0.25±0.03,0.22±0.02,0.23±0.04)均明显低于MDA-MB-453/Ctrl组(0.82±0.03,0.83±0.03,0.82±0.03,0.84±0.03),均有统计学差异(P<0.01);经EGF刺激5min、10min、30min后p-HER2的水平(0.83±0.02,0.71±0.05,0.59±0.03)均明显高于Ctrl组(0.42±0.05,0.17±0.01,0.07±0.03),均有统计学差异(P<0.01);p-Akt的水平(0.84±0.05,0.63±0.04,0.46±0.03)均明显高于Ctrl组(0.44±0.03,0.24±0.03,0.06±0.02),均有统计学差异(P<0.01);p-ERK的水平(0.83±0.02,0.86±0.02,0.79±0.02)均明显高于Ctrl组(0.44±0.04,0.27±0.04,0.17±0.03),均有统计学差异(P<0.01)。结论:1下调FLNa的表达水平可促进HER2阳性乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖、迁移和侵袭。2 FLNa通过调控HER2阳性乳腺癌MDA-MB-453细胞HER2的活化即磷酸化水平,调节MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路中激酶的活化,最终影响MDA-MB-453细胞的生物学行为。