研究目的:本课题研究Nrp-1和Helios在tTreg,pTreg和iTreg细胞表达的差异,通过体内体外实验观察Nrp-1⁺iTreg细胞的功能和稳定性,尤其在炎症状态下Nrp-1⁺iTreg细胞的免疫调节作用和稳定性,并探讨其发挥免疫抑制作用和维持免疫稳态的机制。研究方法:1.流式细胞术（FCM）法检测B6Foxp3GFP小鼠脾脏CD4、CD8、CD19、CD11c、NK1.1、CD11b阳性细胞Nrp-1和Helios的表达水平。以及检测小鼠胸腺、淋巴结、脾脏和外周血细胞CD4⁺Foxp3+T细胞和CD4⁺Foxp3-T细胞Nrp-1和Helios的表达水平。2.构建骨髓移植模型,FCM法检测移植8周后淋巴结、脾脏和外周血CD4⁺Foxp3+T细胞和CD4⁺Foxp3-T细胞Nrp-1和Helios的表达水平。3.在不同条件下体外培养获得Th0、Th1、Th2、Th17、CD4_medT和iTreg细胞,检测各自Nrp-1和Helios的表达水平。4.IL-2和TGF-β条件下体外培养iTreg细胞,检测第0、2、3、7和13天Nrp-1和Helios的表达水平。5.体外诱导iTreg细胞,加入Smad3抑制剂（SIS3）、J-NK抑制剂（JNKi）或I型TGF-β受体（ALK5）抑制剂（ALK5i）或DMSO对照,比较不同抑制剂对iTreg细胞Nrp-1和Helios表达的影响。6.体外分选出Nrp-1⁺iTreg和Nrp-1-iTreg细胞,体外直接培养后第4和7天检测Foxp3GFP、IFN-γ和IL-17A表达水平;或经尾静脉输注到B6 Rag1-/-小鼠,第4、7和12天后检测Foxp3GFP、IFN-γ和IL-17A表达水平。7.Nrp-1⁺iTreg、Nrp-1-iTreg 和 Nrp-1-Foxp3-CD4⁺T 细胞抑制 CD4⁺CD25-T细胞增殖的差异比较。8.采用B6 Rag1-/-小鼠,腹腔注射CD4⁺CD25-CD45RBhi T细胞,诱导T细胞介导肠炎模型。分为 5 组,CD4⁺CD25-CD45RBhiT 细胞,CD4⁺CD25-CD45RBhiT细胞 +Nrp-1⁺iTreg,CD4⁺CD25-CD45RBhiT 细胞 +Nrp-1-iTreg 细胞,CD4⁺CD25-CD45RBhiT 细胞+ Nrp-1+Foxp3-CD4⁺T,CD4⁺CD25-CD45RBhiT 细胞+Nrp-1-Foxp3-CD4⁺T,观察小鼠体重变化、肠道病理,肠系膜淋巴结细胞IFN-γ,IL-17A和Foxp3表达水平。9.体外诱导得到小鼠CD4⁺iTreg细胞,检测Nrp-1⁺iTreg和Nrp-1-iTreg细胞IL-10和IL-10R表达水平。进一步分选出Nrp-1⁺iTreg和Nrp-1-iTreg体外培养静息培养4天,然后再刺激50小时,以及不同细胞因子IL-2或IL-27条件下,检测IL-10和IL-10R表达水平。实验结果:1.FCM结果显示,小鼠脾脏CD4⁺T、DC和NK细胞显著表达Nrp-1,而Helios主要在CD4⁺T细胞表达;Nrp-1和Helios在胸腺CD4⁺Foxp3+T细胞（tTreg）都表达,Nrp-1表达水平低于Helios,然而Helios在胸腺CD4⁺Foxp3-T细胞也有较高的表达。另外,Nrp-1和Helios在淋巴结、脾脏和外周血CD4⁺Foxp3+T细胞表达,但Nrp-1表达水平高于Helios。2.骨髓移植重建模型结果显示,8周后分离得到淋巴结、脾脏和外周血,CD4⁺Foxp3+T 细胞（pTreg）显著表达 Nrp-1 和 Helios。3.IL-2和TGF-p体外培养的iTreg细胞Nrp-1和Helios表达明显升高,尤其在CD4⁺Foxp3+iTreg 细胞,Nrp-1 在 CD4_medT 细胞（IL-2,无 TGF-β 条件下）低表达,Helios 在 CD4_medT 细胞有一定的表达。Th0、Th1、Th2 和 Th17 细胞 Nrp-1 和 Helios低表达。4.体外培养的iTreg细胞第3-13天Nrp-1明显升高,Nrp-1+/Foxp3+达70%左右;Helios表达水平在第3天达高峰,之后表达下降。5.体外培养的iTreg细胞表达Nrp-1和Helios依赖于TGF-β信号（ALK5i）,不依赖于Smad3和JNK信号通路。6.体外稳定性实验显示,Nrp-1⁺iTreg和Nrp-1-iTreg体外培养第4和7天,Nrp-1⁺iTreg细胞Foxp3GFP表达水平高于Nrp-1-iTreg细胞,而IFN-y表达水平低于Nrp-11iTreg细胞。体内稳定性实验显示,细胞输注后第4、7和12天Nrp-1⁺iTreg细胞Foxp3GFP表达水平高于Nrp-1-iTreg细胞,而第7和12天IFN-γ和IL-17A表达水平低于Nrp-1-iTreg细胞。7.体外抑制实验显示,Nrp-1⁺iTreg和Nrp-1-iTreg细胞都能抑制CD4⁺CD25-T细胞增殖,Nrp-1⁺iTreg的抑制作用优于Nrp-1-iTreg细胞,而Nrp-1-Foxp3-CD4⁺T细胞没有抑制功能。8.体内抑制实验显示,Nrp-1⁺iTreg,Nrp-1-iTreg,Nrp-1+Foxp3-CD4⁺T和Nrp-1-Foxp3-CD4⁺T细胞分别与CD4⁺CD25-CD45RBhiT细胞一同转移至Rag1-/-小鼠,后两群Foxp3-CD4⁺T细胞不能抑制肠炎;而前两群iTreg细胞都能抑制肠炎,减缓体重下降,减轻肠道炎症,抑制Th1和Th17细胞,Nrp-1⁺iTreg的抑制功能优于Nrp-1-iTreg细胞。进一步检测发现,Nrp-1⁺iTreg来源细胞Foxp3表达高于Nrp-1-iTreg,IFN-γ和IL-17A表达水平低于Nrp-1-iTreg细胞,提示Nrp-1⁺iTreg在炎症状态下具有更强的免疫抑制功能和更好的稳定性。9.体外实验显示,Nrp-1⁺iTreg细胞IL-10和IL-10R表达水平高于Nrp-1-iTreg。静息培养4天后再刺激,无细胞因子或IL-2或IL-27条件下,Nrp-1⁺iTreg细胞IL-10和IL-1 OR表达水平都高于Nrp-1-iTreg细胞。结论:1.Nrp-1在正常小鼠胸腺和外周淋巴器官Foxp3+CD4⁺T细胞高表达,也在造血干细胞来源的外周Treg细胞（pTreg）和体外诱导Treg细胞（iTreg）高表达,而在其他效应细胞Th1/Th2/Th17低表达,提示Nrp-1不仅在tTreg和pTreg细胞表达升高,还是iTreg细胞表面标志;Helios虽然在tTreg细胞、pTreg和iTreg表达较高水平,但Helios在胸腺CD4⁺Foxp3-T细胞和体外激活的CD4⁺Foxp3-T细胞(IL-2,无TGF-β条件下培养CD4_medT细胞)表达,提示Helios特异性不高,不能作为tTreg和iTreg细胞的标志。2.在非炎症状态下,体内和体外实验证实Nrp-1⁺iTreg细胞抑制功能和稳定性优于Nrp-1-iTreg细胞;在炎症状态下,Nrp-1⁺iTreg细胞仍具有抑制功能和稳定性,优于Nrp-1-iTreg细胞,其机制可能与Nrp-1⁺iTreg细胞高表达IL-10和IL-10R,维持Foxp3的表达,向Th1和Th17细胞分化抵抗有关。3.我们鉴定了一群具有免疫抑制功能和高稳定性的Nrp-1⁺iTreg细胞,容易体外培养和获取,为临床提供大量Nrp-1⁺iTreg细胞,不像tTreg和pTreg细胞因数量少而限制应用。这些发现为临床应用诱导型Nrp-1⁺iTreg细胞治疗自身免疫炎症性疾病奠定了理论基础。