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创伤、肿瘤等病因导致的大段骨缺损一直是困扰骨科医师的难题。治疗方法主要有自体骨移植、异体或异种骨移植、生物材料填充等。自体骨移植是治疗骨缺损最有效的方法及金标准,但自体骨往往不能满足较大骨缺损对植骨量的要求,同时会造成供骨区新的创伤;而异体或异种骨移植以及生物材料等但均难以获得满意的疗效。近年来组织工程骨的研究为骨缺损修复带来了新的希望。骨组织工程学的原理是运用工程学和生命科学技术构建具有生物功能的人工骨,主要包括三个方面:种子细胞、支架材料以及组织工程骨的构建。间充质干细胞(MSCs)是组织工程骨较理想的种子细胞,根据其基因来源可分类为自体组织工程骨和异基因组织工程骨。目前主要研究的是自体组织工程骨,动物实验显示有较好的成骨能力并成功修复了骨缺损;临床试验也获得成功并取得了较好的效果。但自体组织工程骨因不能预构建、常有3~4w等待期等不足限制了其在临床应用以及产业化。异基因组织工程骨可克服这些不足,能满足“随取随用”的临床应用宗旨。异基因MSCs构建的组织工程骨能否进入临床应用取决于免疫原性以及成骨能力。其免疫原性主要与种子细胞相关。研究显示MSCs仅表达MHC-I,不表达MHC-II、Fas/FasL、CD80、CD86、CD40和CD40L;体外实验:混合淋巴培养(MLC)显示其并不引起异体淋巴细胞的增殖及活化;体内实验:同种异体MSCs在体内能较长时间存在而不被识别清除;因此认为MSCs免疫原性低甚至无免疫原性。近来亦认为MSCs具有免疫抑制作用,可诱导免疫耐受。MSCs经成骨诱导后其免疫原性无显著增强,不引起异体淋巴细胞增殖反应。关于异基因骨组织工程的报道不多,涉及免疫原性的研究更少。De Kok等应用同种异体MSCs构建组织工程骨修复了狗牙槽骨缺损,通过循环抗体检测证实无免疫排斥反应;Hiroyuki等构建异基因组织工程骨修复大鼠骨缺损的实验中发现使用免疫抑制剂的实验组骨缺损能够较好的被修复,而未使用组成骨较困难,不能修复骨缺损;显示异基因组织工程骨的成骨能力与其免疫原性密切相关。目前异基因组织工程骨的研究仅限于鼠等小动物,移植排斥研究仅有外周体液免疫检测以及应用抑制剂进行对比且获得的结论也不确定。本实验拟进行大动物实验,选用了在器官以及免疫系统等与人类相似的猪为实验动物。贵州小香猪和广西巴马猪两种近交系小型猪分别为实验供体、受体,建立小型猪胫骨干中段2cm的节段骨缺损模型。探讨了小型猪骨髓MSCs的分离纯化以及鉴定,异基因组织工程骨体外构建。根据异基因组织工程骨移植的特点,运用流式技术、ELISA、RT-PCR、免疫组化等方法监测术后的移植排斥情况,并通过X线检查、组织的特殊染色、生物力学测试等观察成骨效果。主要的结果和结论如下:1.微量淋巴细胞毒实验(CDC)显示贵州小香猪和广西巴马猪品系间呈强阳性,品系内成阴性结果;单向混合淋巴细胞培养(MLC)结果显示两品系猪间猪白细胞表面抗原(SLA)不相容,品系内相容性好。结论:贵州小香猪和广西巴马猪是品系较纯的两种品系猪,品系间完全不匹配,即两品系猪之间器官移植发生排斥可能性大,符合实验目的。2.构建小型猪胫骨干中段2cm的节段骨缺损模型,采取钢板固定,通过术后X线检查,12 w大体标本以及组织学均显示未能骨愈合。结论:小型猪胫骨干2cm的节段骨缺损模型能够满足实验要求。3.比较Percoll及Ficoll两种介质结合贴壁法分离纯化小型猪骨髓MSCs,结果显示Percoll介质结合贴壁法获得的MSCs具有较好的活力、纯度以及成骨活性。经鉴定符合MSCs的属性。结论:Percoll介质结合贴壁是分离纯化小型猪骨髓MSCs的适宜方法。4.小型猪MSCs不能刺激异基因淋巴细胞活化、增殖;MSCs经成骨诱导不同时间后也不能刺激异基因淋巴细胞增殖;提示小型猪MSCs及其经成骨分化后的免疫原性均较低。MSCs与多孔β-TCP复合构建组织工程骨;高浓度MSCs通过沉淀法可获得较高的上架率;β-TCP对MSCs的细胞活力以及免疫原性无明显影响。5.免疫学监测的实验分组:A异基因组织工程骨组;B自体组织工程骨组;C纯TCP组;D空白缺损组。术后免疫学监测发现:各实验组术后外周血CD4+、CD8+和CD4+CD8+双阳性细胞无显著变化;A组在同一时间点的CD4+、CD8+和CD4+CD8+细胞值与其余实验组比较无明显差异;术后早期淋巴细胞转化试验显示各实验组的SI <2;A组术后单向MLC检查淋巴细胞增殖不明显,T淋巴细胞毒实验测得细胞毒性活力较低;ELISA检测各实验组术后早期血清IL-2、IL-10,发现IL-2在早期呈逐渐升高趋势,A组、B组和C组在术后3d时升高较明显(P<0.05),1w时已开始下降,组间在同一时间点血清的IL-2水平无显著差异;各实验组术后早期IL-10水平呈轻度升高,但不显著,2w后逐渐恢复正常,组间比较无显著差异;RT-PCR检查IL-2、IL-10 mRNA的表达显示A组、B组和C组在术后早期(1w)上调,D组不明显。A组与B和在同一时段IL-2和IL-10 mRNA的表达无显著差异;组织观察:A组、B组和C组早期均有少量的炎症细胞以及的淋巴细胞以及单核细胞浸润。免疫组化显示A组和B组有少量CD4+、CD8+细胞存在,两组间无明显差异。A组和B组在术后早期可见在支架空隙内有微弱的IgG复合物的沉积,未见C3的沉积。C组和D组未见IgG、C3的沉积; A组术后8w可见新生骨的细胞呈BrdU阳性标记。结论:异基因组织工程骨移植后早期有轻度的炎症反应,未能监测有明显的排斥反应,移植的异基因细胞存活并成骨。显示MSCs为种子细胞的异基因组织工程骨的免疫原性低。6.成骨观察分为三组(A:异基因组、B:自体组、C:纯TCP),结果显示:术后各组X线检查见钢板螺钉固定好,TCP逐渐降解,为新生骨取代,并逐渐桥接骨缺损区;A组同期的X线评分较C组明显(P<0.05),和B组比较无显著区别。术后A组I型胶原和骨钙素的mRNA的表达均逐渐上调,明显强于C组(P<0.05),和B组比较无明显差异。组织检查:可见β-TCP逐渐降解,新生幼稚编织骨及血管逐渐形成,最终被成熟骨组织取代;组织学评分A组较C组有显著差异(P<0.05),与B组无显著差异。天狼星红染色显示A组I型胶原生成较C组多(P<0.05),A和B组间差异不明显。术后8 w时A组可见新生骨的细胞呈BrdU阳性标记。术后16w墨汁灌注显示A和B组血管化水平较高,C组差。骨密度检查:A、B和正常的骨密度较接近,A组与C组比较有统计学意义。生物力学测试A组优于C组。结论:异基因组织工程骨具有很好的成骨能力能较好修复节段骨缺损,另一方面也显示成骨活动不受免疫原性的影响。全文结论:异基因组织工程骨移植后未检测到有排斥反应存在,修复骨缺损可获得与自体组织工程骨相似的疗效。显示异基因组织工程骨免疫原性低或无,成骨能力好。本实验为异基因组织工程骨进入临床应用提供了实验基础。