金鲳鱼肉质细嫩,味道鲜美,营养价值高,是我国南方沿海重要的海产经济鱼类,近年来其市场需求量不断上升。随着金鲳鱼加工规模的增大,产生了大量的废弃物,如:鱼头、鱼骨和内脏等,约占整鱼质量的40%-55%,这些物质常被丢弃,不仅污染环境而且浪费资源。内脏中含有丰富的蛋白酶,具有广阔的应用开发前景。然而,目前关于金鲳鱼内脏酶类资源的研究利用较少,因此,金鲳鱼内脏的研究显得尤其重要。本实验以金鲳鱼内脏为原料,分离纯化其中的两种天冬氨酸蛋白酶,研究了蛋白酶的酶学性质,探讨了它们在提取大分子胶原、制备明胶水解产物和凝乳方面的应用,以期为金鲳鱼内脏的开发应用提供参考。实验结果如下:1、两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶的分离纯化以金鲳鱼内脏为原料,依次采用pH 7.0磷酸钠缓冲液浸提、0-55%硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析和Sephadex G-50凝胶层析等方法分离得到第一种天冬氨酸蛋白酶,记作AP-V。采用血红蛋白为底物,测定其比酶活为45.72 U/mg,纯化倍数为17.79,活性回收率为20.95%。以金鲳鱼胃部为原料,依次采用pH 7.0磷酸钠缓冲液浸提、0-40%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析等方法分离得到第二种天冬氨酸蛋白酶,记作AP-S,同样采用血红蛋白为底物,测定其比酶活为98.72U/mg,纯化倍数为4.25,活性回收率为21.5%。2、两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶的酶学性质本文首先采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定两种蛋白酶的分子量,其次以血红蛋白为底物,研究了 pH、温度、NaCl、抑制剂、金属离子对两种蛋白酶活性的影响,最后以米氏常数为指标,研究了两种酶对血红蛋白的水解能力。结果显示,金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶(AP-V)和金鲳鱼胃部天冬氨酸蛋白酶(AP-S)的分子量分别为18.5kDa和36.1kDa; AP-V和AP-S的最适pH分别为4.0和2.0,两种蛋白酶均为酸性蛋白酶,相比于AP-V,AP-S在酸性条件下稳定性更好;AP-V和AP-S最适温度分别为35和50℃C,两种蛋白酶在20-40℃C下都能保持较高的活性;随着NaCl浓度的升高,AP-V的活性逐渐减低,而AP-S的酶活性先增加后减小;蛋白酶抑制作用实验结果表明:丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、金属蛋白酶抑制剂(EDTA)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E-64)对两种酶的活性均没有抑制作用,而天冬氨酸蛋白酶抑制剂(pepstatin A)对两种酶的活性有强烈抑制作用,说明两种酶活性中心都含有天冬氨酸,属于天冬氨酸蛋白酶类;Na+、K+、Ca2+和Zn2+对两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶的活性影响很小,而Mg2+对两种酶的活性均有显著激活作用,Hg2+对两种酶的活性均有抑制作用;AP-V和AP-S的米氏常数Km分别为10.13g/L和5.78g/L, AP-S对血红蛋白的水解能力强于AP-V。3、两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶的应用研究为了探讨两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶在提取罗非鱼鱼鳞胶原方面的应用前景,利用AP-V和AP-S辅助提取罗非鱼鱼鳞胶原,并与猪胃蛋白酶作为对比,结果发现,AP-S辅助提取罗非鱼鱼鳞胶原的得率高于AP-V,与猪胃蛋白酶接近,并且两种金鲳鱼蛋白酶提取得到的胶原蛋白均为Ⅰ -型胶原。为了探讨两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶在制备明胶水解产物方面的应用,利用AP-V和AP-S酶解罗非鱼鱼皮明胶,并与猪胃蛋白酶对比,结果发现AP-V酶解能力强于AP-S和猪胃蛋白酶。为了探究两种金鲳鱼内脏天冬氨酸蛋白酶在乳制品加工方面的应用前景,测定了 AP-V和AP-S的凝乳活性,并与猪胃蛋白酶对比,结果发现AP-S的凝乳能力与猪胃蛋白酶接近,而AP-V未检测出凝乳活性。实验结果说明AP-S有望作为潜在的凝乳酶替代物。