论文部分内容阅读
背景:骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种侵袭性骨癌,目前骨肉瘤的治疗方法主要为基于相关指南的标准治疗方案,包括手术切除、化疗、靶向治疗以及放疗等。骨肉瘤患者的5年生存率大约为60～70%;局部进展期、转移或者复发患者的五年生存率仅为20%。令人遗憾的是,尽管放化疗、靶向治疗以及其他多种辅助治疗的方法已经在大多数患者中应用,但是骨肉瘤患者的术后生存时间并未发生显著延长。传统治疗方法在骨肉瘤的治疗方面受到了限制。通过寻找基于肿瘤患者遗传学或表观遗传学的异常改变的治疗靶点,为提高骨肉瘤治疗效果,改善患者预后提供了可能。这其中,Micro RNAs(mi RNAs)已经得到了广泛的研究,mi RNAs在肿瘤的发生和发展中既可能发挥促癌作用,又可能发挥抑癌功能。当某种mi RNAs是促癌基因时,其过表达将促进肿瘤的发展;相反,如果某种mi RNAs是抑癌基因,则其过表达将抑制肿瘤的发展。例如,mi R-135b、mi R-150、mi R-542-5p和mi R-652等已被证实在骨肉瘤细胞中异常表达。mi R-615-5p在肝癌、淋巴瘤和恶性胶质瘤等多种肿瘤组织中的表达水平下调,且这种异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等存在直接或间接关系。mi R-615-5p的靶目标包括AKT、IGF1/IGF2等。AKT1基因的生理功能为编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,有研究认为,AKT1的上调促进了骨肉瘤的肺转移,AKT1的下调能够明显抑制MAT1介导的骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭的促进作用,抑制异种移植裸鼠的肿瘤生长,减少转移性肺肿瘤的数量。因此,mi R-615-5p在多数肿瘤中具有显著的抑癌作用,AKT1信号通路在肿瘤的发生和发展过程中具有重要的作用,其在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的作用得到了确认,并且多种AKT1的调控因子已经被发现,但具体mi R-615-5p和AKT1在骨肉瘤中功能,以及两者相互作用关系仍有待进一步研究。目的:拟通过分子生物学实验探讨mi R-615-5p/AKT1调控轴在骨肉瘤中的表达水平,以及对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。方法:收集29例2018年6月至2019年6月在我科手术治疗的骨肉瘤患者的癌变组织及癌旁正常组织。经中国科学院细胞研究所购买并培养骨肉瘤细胞(U2OS)及人正常成骨细胞(h FOB)。(1)q RT-PCR法检测癌变组织及癌旁正常组织、U2OS细胞及h FOB细胞中mi R-615-5p表达水平。(2)将U2OS细胞分为对照组、过表达组及无义对照组,分别用脂质体将mi R-615-5p模拟物及无义RNA转染至骨肉瘤U2OS细胞中,q RT-PCR检测细胞中mi R-615-5p表达水平,考察转染效率。(3)CCK-8法检测各组细胞活力及增殖情况。(4)划痕实验检测各组细胞侵袭能力。(5)Transwell实验检测各组细胞体外迁移能力。(6)通过生物信息学软件Targetscan7.2获取mi R-615-5p及AKT1的序列信息,考察二者序列是否具有片段性互补序列,分析二者可能存在的结合位点。(7)Western blot法检测三组细胞AKT1蛋白表达水平。(8)双荧光素酶报告实验检测mi R-615-5p和AKT1的结合关系。结果:(1)骨肉瘤对mi R-615-5p表达水平影响。(1)骨肉瘤组织中mi R-615-5p的相对表达水平低于癌旁正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)U2OS细胞中mi R-615-5p的相对表达水平低于h FOB细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)mi R-615-5p过表达对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。(1)过表达组mi R-615-5p的相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞的细胞活力和增殖能力显著抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞组的划痕愈合程度远低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞组的穿过小室细胞数量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)考察mi R-615-5p通过AKT1影响U2OS细胞生物学行为的相关机制。(1)序列对比结果显示,mi R-615-5p与AKT1 3’-UTR存在结合位点。(2)mi R-615-5p过表达后,U2OS细胞AKT1蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)双荧光素酶报告基因分析mi R-615-5p与AKT1表达相互作用结果显示,与Control组比较,在转染mi R-615-5p的细胞中,AKT1 3’-UTR WT的荧光素酶活性下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)mi R-615-5p在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系U2OS中低表达。(2)mi R-615-5p过表达可抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)AKT1是mi R-615-5p的直接靶点,mi R-615-5p可通过AKT1调控U2OS细胞的生物学行为。(4)本研究发现,mi R-615-5p可能是骨肉瘤的潜在分子治疗靶点。