论文部分内容阅读
COX-2(Cyclooxygenase-2)是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的关键限速酶。由于COX-2参与了机体的诸多病理生理过程,如促进炎症进程,促进血管生成,促进肿瘤的发生发展,增强肿瘤细胞的耐药性等;使得它成为肿瘤治疗的一个重要靶点。鉴于当前针对COX-2的抑制剂在临床应用中会产生严重的毒副作用,建立以COX-2为靶点的靶向、安全、高效的肿瘤治疗的新策略具有重要意义。而单链抗体凭借其高亲和力、高特异性、组织穿透力强、免疫原性小等优点,已经在临床上以多种形式被应用,在肿瘤诊断和治疗中具有独特的优势。本实验室前期已经成功制备了能在体内外特异性结合COX-2,并抑制其生物学活性的人源单链抗体,内质网滞留型的抗COX-2胞内单链抗体有效抑制肿瘤细胞的生长增殖、迁移、体外侵袭能力,并且能够促进肿瘤细胞的凋亡。此外利用噬菌体随机肽库筛选、计算机模拟对抗COX-2单链抗体与COX-2分子间相互识别的机制进行了研究,初步推测了抗COX-2单链抗体抑制COX-2功能的可能机制。但具体的机制仍需进一步实验验证,因此本研究在前期噬菌体随机肽库筛选、计算机模拟的结果基础上,通过突变实验进行验证分析,确定抗原抗体相互作用模式及关键氨基酸,进而揭示抗原抗体相互作用的分子基础。目前取得以下结果:1.成功构建5种COX-2缺失突变体的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化了纯度达95%以上的具有较好活性的5种COX-2缺失突变体。2.ELISA实验发现,COX-2缺失突变体与抗COX-2人源单链抗体的相互作用表位分布于466-604位氨基酸之间。3.成功构建4个COX-2定点突变体的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化了纯度达95%以上的具有较好活性的4个COX-2定点突变体,分别为trCOX-2 V523A,trCOX-2 S530A,and trCOX-2 L534A,trCOX-2 N537A。4.ELISA鉴定定点突变体与OX-1结合活性结果显示,第523位Val,530位Ser,534位Leu,537位Asn氨基酸都参与了COX-2的表位形成,并且530位Ser在该表位中担任着至关重要的作用。综上所述,我们通过缺失突变和点突变分析,初步确定了抗COX-2单链抗体与COX-2相互作用的关键氨基酸的区段以及关键氨基酸,这为以COX-2为靶点的抗体肿瘤治疗奠定了分子基础。