【摘 要】
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蛋白质药物是一类可用于治疗癌症、传染病、心血管疾病和神经性疾病等危害人类生命安全的严重疾病的有效药物,具有活性高、毒副作用小、作用位点专一且生物功能明确的优点,在临床上发挥着越来越重要的作用。近年来,随着重组DNA技术的飞速发展,蛋白质药物可以通过基因技术大量获得,很快成为生物医药行业发展的热点。目前重组蛋白质药物制备过程中存在的分离提纯效率低、成本高和蛋白质大分子本身分子量相对较小,半衰期短等两
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蛋白质药物是一类可用于治疗癌症、传染病、心血管疾病和神经性疾病等危害人类生命安全的严重疾病的有效药物,具有活性高、毒副作用小、作用位点专一且生物功能明确的优点,在临床上发挥着越来越重要的作用。近年来,随着重组DNA技术的飞速发展,蛋白质药物可以通过基因技术大量获得,很快成为生物医药行业发展的热点。目前重组蛋白质药物制备过程中存在的分离提纯效率低、成本高和蛋白质大分子本身分子量相对较小,半衰期短等两大问题。因此,本课题构建了一个双功能型纤维素MONOLITH材料来实现对重组干扰素α-2b的高效分离提纯和聚乙二醇定点长效化修饰。主要研究内容如下:1、基质材料醋酸酯纤维素和纤维素MONOLITH材料的制备:以醋酸酯纤维素CA出发,通过热引发相分离法制备醋酸酯纤维素CA MONOLITH材料,再通过碱性水解的方法来得到同时具有大孔和介孔的多层次孔洞结构的纤维素CE MONOLITH材料。利用FT-IR、SEM和氮气吸附/脱附等手段对材料进行了表征,通过改变TIPS的制备参数如CA溶液浓度和混合溶液的比例来调整CA MONOLITH材料的内部形态,筛选出了最佳的制备工艺为:CA的浓度是220 mg/m L,混合溶剂1-正己醇/DMF的体积比为1.4/1,得到比表面积分别为32.28 m~2/g和30.87 m~2/g的CA和CE MONOLITH材料;在制备CE MONOLITH材料时,通过对碱性水解的温度和水解的时间进行考察达到最佳的水解效果,最佳的碱性水解条件为:水解温度为30°C,水解时间为3 h。通过水解前后的SEM可知,水解后的CE MONOLITH内部的形态保留了原有的多层次孔洞结构。2、用于重组干扰素α-2b分离提纯的功能型纤维素MONOLITH材料的制备:首先利用CE MONOLITH材料表面的羟基与乙二胺四乙酸二酐EDTAD发生酯化反应,引入EDTA配体,再螯合金属镍离子Ni2+构建成IMAC的固定相。然后利用构建的Ni2+-EDTA-CE MONOLITH材料对带有His标签的干扰素α-2b进行了分离和提纯。利用FT-IR、SEM、原子吸收和SDS-PAGE等手段对得到的材料和提纯后的干扰素α-2b进行了表征,FT-IR谱图结果确定了EDTA配体成功的引入到MONOLITH材料上,并且通过SEM可知引入EDTA后材料保留了原有的内部形态;通过改变Ni2+的初始浓度,计算出EDTA-CE MONOLITH材料的最大镍离子吸附能力为132.86 mg/g;通过SDS-PAGE电泳可知Ni2+-EDTA-CE MONOLITH材料对带有His标签的IFNα-2b具有较高的亲和性和特异性,经Bradford方法计算Ni2+-EDTA-CE MONOLITH材料的最大吸附量为29.17 mg/g;最后考察了材料的重复利用性能,结果表明在5次连续重复使用后,材料仍能保持90.6%的分离提纯效率,具有优越的重复利用性能。3、用于重组干扰素α-2b定点长效化修饰的功能型纤维素MONOLITH材料的制备:首先利用CE MONOLITH材料表面的羟基与甲基丙烯酸酐MAA发生酯化反应成功引入双键官能团,再通过点击化学的方法在MAA-MONOLITH表面引入高反应活性的琥珀酰亚胺酯NHS基团得到NHS-CE MONOLITH,通过固定床流通的方法实现谷氨酰胺转氨酶的高效固定,从而实现了对干扰素IFNα-2b的定点长效化修饰。利用FT-IR、元素分析、圆二色光谱和MALDI-TOF质谱等手段对得到的材料和修饰后IFNα-2b进行了表征:通过FT-IR谱图确定了MAA成功的与CE MONOLITH成功发生反应引入双键官能团;通过元素分析和NHS基团的测定确定高活性的NHS基团成功引入到MAA-CE MONOLITH材料上,且引入量为187.94μmol/g;通过Bradford和酶活的测定可知,NHS-CE MONOLITH材料对TGase酶的固定能力为38.6 mg/g,具有优越的酶固定量,且活性保持为16.27%;在TGase-CE MONOLITH的介导催化作用下,通过SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF质谱等表征手段确定得到了定点单修饰的PEG5k-IFNα-2b。
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