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原发性支气管肺癌(primary bronchogenic carcinoma)简称肺癌(lung cancer),是临床最常见的恶性肿瘤之一。由于吸烟、环境污染等因素,近年来我国肺癌发病率呈逐年上升趋势。由于其发病过程隐匿,缺乏良好的早期诊断指标,大部分肺癌患者就诊时已处于中晚期,预后不良。肺癌的发生与多个基因、多条信号通路的异常相关,因此,研究肺癌发生发展过程中的相关基因及其作用机制具有重要的临床意义。HES5编码基因定位于人类染色体1p36,属于碱基-螺旋-环-螺旋(Basic helix-loophelix proteins,bHLH)家族成员。HES5基因是Notch信号通路下游靶分子,作为转录因子,HES5通过与靶基因启动子区的N盒元件(CACNAG)结合调节基因的表达,参与调节多种组织细胞的分化。研究表明HES5基因的异常表达能促进细胞的增殖,与多种恶性肿瘤相关,在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。目前在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中HES5所发挥的作用及其机制尚不清楚。本课题研究HES5在肺腺癌中的表达和临床意义,及其对肺腺癌细胞增殖的影响,并初步探讨其作用机制。一、HES5在肺腺癌中的表达及其与Ki67、临床病理特征和预后的关系目的:在组织水平,研究HES5在肺腺癌中的表达及其与临床病理参数的相关性,分析HES5的表达状况对患者预后的影响。方法:1.收集8组新鲜肺癌腺癌术后患者的癌组织及相对应的癌旁正常肺组织,在组织水平,采用免疫印迹分析实验法(Western Blot,WB)检测HES5蛋白在肺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达状况,并比较差异。2.收集114例2005.01至2009.12期间手术切除的肺腺癌肿瘤组织标本。使用免疫组织化学染色实验法(immunohistochemistry,IHC)检测HES5蛋白和细胞核抗原(Ki67)蛋白的表达情况;分析HES5蛋白的表达与肺腺癌患者各项临床病理参数及Ki67表达之间的相关性;探讨HES5的表达对于患者预后的影响。结果:1.在8组成对的肺腺癌肿瘤组织及其相对应的癌旁正常肺组织中,Western Blot示HES5蛋白在癌组织中的表达高于癌旁正常肺组织(P<0.05)。2.通过IHC检测发现HES5在肺腺癌肿瘤组织细胞核和细胞浆中均有表达,而Ki67主要定位于细胞核;HES5的表达与患者肿瘤大小、临床分期、组织病理分化程度、淋巴结转移状态存在相关性(P<0.05)。Spearman等级相关分析显示,HES5与Ki67表达呈正相关(r=0.591,P<0.01)。Kaplan–Meier生存曲线分析提示HES5高表达病例预后较低表达病例差,其总生存期低于HES5低表达的患者(P<0.05)。COX模型多因素分析结果显示,HES5的表达状态、Ki67的表达状态和组织分化程度是影响肺腺癌患者预后的独立因素。结论:HES5在肺腺癌肿瘤组织中呈高表达,与肿瘤大小、临床分期、组织分化程度和淋巴结转移状态相关,与细胞增殖相关指标Ki67的表达呈正相关,HES5高表达预示患者预后不良。二、HES5的表达对人肺腺癌A549细胞增殖的影响目的:在细胞水平,研究HES5对肺腺癌细胞增殖的影响。方法:1.收集3种人肺腺癌细胞系(A549、H1299和Spca-1),采用Western Blot法检测HES5蛋白在肺腺癌细胞系中的表达状况。2.HES5高表达肺腺癌细胞株进行饥饿释放实验,采用流式细胞细胞仪检测实验过程中细胞周期的变化,采用Western Blot检测实验过程中HES5、周期相关蛋白(Cyclin D1)及增殖指标蛋白PCNA的表达变化。3.采用siRNA(Small interfering RNA,siRNA)干扰HES5的表达,通过脂质体转染法将HES5-siRNA转染至人肺腺癌细胞中,建立HES5基因沉默的肺腺癌细胞株。采用流式细胞仪分析干扰HES5表达后对细胞周期的影响,采用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit,CCK8)实验和克隆形成实验分析干扰HES5的表达后细胞增殖能力和克隆形成能力的变化,采用Annexin V FITC分析干扰HES5的表达后对细胞凋亡的影响。结果:1.在三种人肺腺癌细胞系(A549,H1299和Spca-1)中,A549细胞HES5蛋白表达水平较高。2.通过血清饥饿释放处理A549细胞,血清饥饿处理后细胞增殖进程受到抑制,恢复血清培养后,细胞开始增殖由G0/G1逐步进入S期,并且HES5的表达随着细胞的增殖而增加,同时Cyclin D1及PCNA的表达也相应出现了升高。3.通过siRNA技术沉默HES5基因表达后,A549细胞周期受到阻滞,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例下降,并且细胞增殖能力减弱,克隆形成减少,凋亡增多,同时随着HES5表达的下调,Cyclin D1及PCNA的表达也出现了下降。结论:HES5可以影响人肺腺癌A549细胞的增殖,随着细胞增殖,干扰HES5表达可以抑制细胞周期进程,使细胞增殖能力减弱、克隆形成减少、凋亡增加。三、HES5与STAT3通路作用的研究目的:在细胞水平,研究HES5与STAT3通路相互作用的可能机制。方法:1.在人肺腺癌A549细胞株中,采用免疫共沉淀实验验证HES5是否可以与STAT3发生相互作用。2.进一步在人肺腺癌A549细胞中,研究干扰HES5表达后,STAT3及其活化形式p-STAT3的表达变化,并研究STAT3下游靶基因Cyclin D1和Bcl-xl的表达变化。结果:在人肺腺癌A549细胞株中,通过免疫共沉淀实验发现,HES5可以与STAT3相互作用,采用siRNA干扰HES5表达后,STAT3及p-STAT3的表达均出现了下降,同时STAT3的下游靶基因Cyclin D1、Bcl-xl的表达也出现了下降。结论:在人肺腺癌A549细胞中,HES5可以与STAT3相互作用,干扰HES5表达后,可以抑制STAT3的表达及磷酸化,同时下调STAT3通路下游靶基因的表达,影响STAT3信号通路的激活。HES5可能通过STAT3通路影响A549细胞的增殖。