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目的:复方当归注射液由当归、川芎与红花3味中药组成,具有活血通络,祛瘀止痛的作用,近年来临床上广泛用于心血管疾病(Cardiovascular Diseases,CVD)的治疗,但其活性成分和作用机制仍需进一步研究。为此,本文结合化学分析、网络药理学及分子生物学技术对复方当归注射液的主要化学成分和多成分同步含量检测办法及针对治疗CVD的抗炎分子机制进行研究。方法:1.利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱(UPLC-Q-Orbitrap MS/MS)技术建立了复方当归注射液中化学成分的分析方法。借助于质谱仪中化合物精确质量数,结合多级质谱信息以及色谱保留时间等,鉴定复方当归注射液的化学成分。采用高效液相色谱法(HPLC)法建立复方当归注射液多指标成分含量测定分析方法。2.通过中药系统药理学技术平台(TCMSP)和Swiss Target Prediction平台,获得所鉴定的化学成分的作用靶点;利用OMIM、TTD和PharmGkb数据库预测和筛选复方当归注射液治疗心血管疾病的潜在作用靶点;利用Cytoscape3.2.1软件可视化展现药物靶标与疾病靶标的相互作用关系,并使用Network Analyzer插件分析该网络中各个节点的网络拓扑性质,筛选均值以上的靶点为关键靶点;采用数据库DAVID6.8对筛选得到的核心靶点进行基因功能(GO)富集分析(生物过程、分子功能、细胞组成)和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,初步揭示复方当归注射液治疗心血管疾病的作用机制。通过细胞实验对复方当归注射液的药效作初步验证,采用MTT法确定注射液的给药浓度,采用Griess试剂法测定注射液对LPS诱导的RAW 264.7炎性细胞中的NO分泌的影响,并结合谱效关系筛选发挥药效的主要成分。3.以脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7建立炎症反应模型,给予药物干预,分为正常对照组,模型组(LPS),复方当归注射液低、中、高剂量组,关键成分低、中、高剂量组。采用Griess法分别测定各组一氧化氮(NO)的含量,RT-PCR法测定各组诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)mRNA的表达,Western Blot检测各组COX-2、iNOS蛋白表达情况。另采用Western Blot检测了复方当归注射及关键成分对血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达的影响,并利用HO-1特异性抑制剂ZnPP阻断细胞内HO-1表达后,经Griess法测定复方当归注射液及关键成分对LPS诱导的RAW264.7细胞上清中NO的含量。结果:1.根据精确分子量数据和多级质谱碎片,并结合对照品比对,从复方当归注射液中分析共鉴定了6个成分,分别是新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、羟基红花黄色素A和阿魏酸。采用多指标性成分定量分析手段,建立了稳定、快速的HPLC-DAD色谱方法,并利用此方法对市售的14批复方当归注射液进行了质量评价。2.新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、羟基红花黄色素A和阿魏酸等6种成分经Pubchem数据库确证,在TCMSP和Swiss Target Prediction平台中获得其可能作用的靶点589个,从OMIM数据库、TTD数据库以及PharmGkb数据库收集到心血管疾病相关靶点767个,通过STRING数据库对复方当归注射液主要成分作用靶标与心血管疾病相关靶点进行蛋白质间相互作用分析,利用Cytoscape3.2.1软件可视化展现药物靶标与疾病靶标的相互作用关系,使用Network Analyzer插件分析该网络中各个节点的网络拓扑性质,筛选均值以上的靶点为关键靶点,即为复方当归注射液防治心血管疾病的关键靶点,主要包括:白细胞介素-1β(IL-1β)、前列腺素内过氧化物合酶(PTGS2)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)、Toll样受体4(TLR4)等。KEGG通路富集分析得到20条主要的生物信号通路,推测复方当归注射液主要通过对Toll-like receptor signaling pathway、TNF signaling pathway等通路的调节发挥作用,提示复方当归注射液可能通过参与炎症反应发挥治疗心血管疾病的作用。采用LPS诱导的RAW264.7释放NO的细胞模型,评价了复方当归注射液的体外抗炎活性,结合谱效关系的研究方法,筛选得到复方当归注射液抗炎的主要成分可能为隐绿原酸、羟基红花黄色素A、咖啡酸、新绿原酸、绿原酸和阿魏酸。3.复方当归注射液组(2.5、5、10μL·mL-1)及成分隐绿原酸组(100、200、400μmol)均能显著抑制RAW264.7细胞上清中NO的产生,抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎介质及因子iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α的mRNA的表达,并能不同程度地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎介质iNOS、COX-2蛋白的表达,且能促进LPS诱导的RAW264.7细胞中抑炎因子IL-10的mRNA的表达。复方当归注射液及成分隐绿原酸可显著诱导HO-1蛋白的表达,并呈量效关系,且复方当归注射液组(10μL·mL-1)及成分隐绿原酸组(400μmol)均对LPS诱导的RAW264.7细胞上清中NO产生的抑制作用能被ZnPP部分逆转,说明复方当归注射液及成分隐绿原酸通过诱导HO-1蛋白的表达,从而抑制LPS诱导的RAW264.7的炎症反应。结论:本研究采用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS技术从复方当归注射液中鉴定了6种成分,并建立了同步测定6种成分的HPLC-DAD方法。通过网络药理学结果分析,初步揭示了复方当归注射液治疗心血管疾病的作用与调节炎症反应密切相关,且发挥药效的主要成分为隐绿原酸、羟基红花黄色素A、咖啡酸、新绿原酸、绿原酸和阿魏酸。通过LPS诱导的RAW264.7细胞模型,研究了复方当归注射液及成分隐绿原酸抗炎的初步作用机制。本研究为复方当归注射液的质量控制、药效机制及二次开发等深入研究奠定基础,同时也为中药复方的作用机制研究提供了新的研究思路和方法。